拟胚体的状态对小鼠胚胎干细胞神经诱导效率的影响

发布时间：2017-10-08 04:30

  本文关键词：拟胚体的状态对小鼠胚胎干细胞神经诱导效率的影响

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【摘要】：小鼠胚胎干细胞是指由小鼠早期胚胎内细胞团分离并建系的多能干细胞。小鼠胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能。在体外环境中,小鼠胚胎干细胞不仅能自发分化为外胚层、中胚层以及内胚层细胞,还能在含有特殊细胞因子和化学药物的环境中定向诱导分化。由于神经细胞具有不可再生性,因此多年来小鼠胚胎干细胞神经诱导一直是研究较热的一个方向。目前,大多数小鼠胚胎干细胞神经诱导方法还是基于悬浮法形成EBs的分化系统。然而,小鼠胚胎干细胞悬浮法形成的EBs具有形成EBs大小随机以及形成EBs密度随机的缺陷,进而影响神经诱导的效率,最终使得实验可重复性变差。为了尽量缩小小鼠胚胎干细胞向神经诱导分化的实验差异,以便于利用该系统做进一步的神经发育相关研究以及药物筛选,本实验基于Watanabe和Kondo研发的神经诱导方法,采用悬滴法形成的EBs针对EBs的大小以及EBs的密度对神经诱导效率的影响进行了研究,并最终确定了神经诱导效率较高的EBs直径和EBs密度,从而优化了小鼠胚胎干细胞神经诱导方法。
【关键词】：小鼠胚胎干细胞 拟胚体 神经诱导 方法优化
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-11
• 第一部分 引言11-25
• 一、哺乳动物早期胚胎神经发育简介11-12
• 二、胚胎干细胞体外分化为神经细胞12-23
• 1、小鼠ESCs自发分化为神经细胞13-15
• 2、化合物诱导ESCs分化为神经细胞15-16
• 3、ESCs分化细胞的筛选16-19
• 3.1、使用选择性生长培养基富集神经前体细胞17
• 3.2、运用基因工程技术富集神经前体细胞17-19
• 4、利用神经调节基因诱导ESCs向神经方向分化19-20
• 5、使用诱导因子诱导ESCs分化为神经细胞20-23
• 5.1、源自基质细胞的神经分化诱导因子20-22
• 5.2、源自星形胶质细胞的神经分化诱导因子22
• 5.3、源自肝癌细胞系HepG2的神经分化诱导因子22-23
• 三、总结23-25
• 第二部分 实验部分25-53
• 一、实验材料25-26
• 1、实验动物25
• 2、细胞系25
• 3、实验试剂25-26
• 4、实验耗材26
• 5、实验仪器26
• 二、实验方法26-35
• 1、制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）26-27
• 2、制备饲养层细胞27
• 3、R1细胞系的培养27-29
• 4、R1细胞系神经诱导29-32
• 4.1、悬浮法神经诱导29-30
• 4.2、悬滴法神经诱导30-31
• 4.3、单层细胞神经诱导31-32
• 5、免疫荧光实验32
• 6、抽提RNA并制备cDNA32-33
• 7、RT-PCR33-34
• 8、QPCR34-35
• 9、统计分析35
• 三、实验结果35-51
• 1、R1细胞系的培养与全能性鉴定35-37
• 1.1、R1细胞的培养35-36
• 1.2、R1细胞的多能性鉴定36-37
• 2、R1细胞神经诱导分化37-51
• 2.1、EBs直径的大小对于神经诱导效率的影响37-44
• 2.2、EBs的密度对于神经诱导效率的影响44-51
• 四、实验结论及讨论51-53
• 参考文献53-60
• 致谢60

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本文编号：992016