肝脏为γδT细胞胸腺外发育场所的初步验证

发布时间：2017-10-08 19:24

  本文关键词：肝脏为γδT细胞胸腺外发育场所的初步验证

  更多相关文章： 肝脏 γδT细胞 T前体细胞 胸腺外发育 鼠伤寒杆菌

【摘要】：目的肝脏不仅是重要的代谢器官,而且也是一个免疫器官。肝脏中富含天然免疫细胞,其独特的免疫细胞组成对于其功能特点的形成具有重要作用。许多研究表明,成年个体肝脏中含有造血干细胞,将其转输回体内后能发育为各类免疫细胞,并且能长期维持。因此,成年肝脏也被认为具有造血功能的器官,尤其是在骨髓造血功能受到破坏或抑制时,其可能成为机体代偿性造血的髓外造血器官。但该作用和机制尚需深入的研究和证实。肝脏独特的造血功能是否会影响肝脏微环境中免疫细胞的组成和发育分化,该领域尚少有人涉足。肝脏免疫系统的特点之一是富含NKT、NK与γδ T细胞等天然免疫细胞。近年来的研究表明,肝脏中存在一群肝脏驻留的NK细胞,与经典的NK细胞在表型、分布、功能与发育等方面存在巨大差异,认为其可能由肝脏造血细胞发育而来。许多研究也表明,γδT细胞存在胸腺外发育途径,小肠是其发育场所之一。鉴于γδT细胞在肝脏淋巴细胞中所占比例明显高于脾脏、淋巴结及外周血,那么,肝脏是否也可能是γδ T细胞胸腺外发育场所,从而进一步影响肝脏γδT细胞的组成?为了探讨这些问题,本课题在确定肝脏相对于其他免疫器官富含γδT细胞的基础上,从四个方面进行了研究。首先,检测比较了肝脏中CD4CD8双阴性T前体细胞(DN1-DN4)的含量,观察肝脏中T前体细胞含量变化的时间动力学变化。发现肝脏的确存在T前体细胞,且以DN1和DN2细胞居多。其次,通过体外培养和过继转输实验,在功能上验证肝脏中T前体细胞是否具有向γδT细胞发育的潜能。再次,检测了肝脏中是否含有向γδT细胞定向分化的γδT前体细胞,进一步观察其是否具有不同于胸腺γδT前体细胞的表型和功能特点。最后,通过γδ T细胞亚群的分布、细胞表型以及在鼠伤寒杆菌感染时应答特点,初步研究了肝脏γδT细胞的表型和功能特点。方法1、分离提取肝脏、小肠、、皮肤、胸腺、脾脏与淋巴结内的单个核细胞,通过流式细胞术检测其中γδ T细胞的比例。2、通过PMA与离子霉素体外刺激,流式细胞术检测小鼠肝脏、胸腺与脾脏中γδT17与γδT1细胞亚群组成的时间动力学变化曲线。3、通过流式细胞术检测各组织中T前体细胞的含量及肝脏中DN1-DN2的时相变化。4、通过流式细胞术检测肝脏中γδ T前体细胞的表型、转录因子的表达与细胞因子的分泌。5、通过OP9-DL1诱导培养与过继转输实验,观察肝脏或胸腺来源的T前体细胞向γδ T细胞发育的能力。6、通过灌胃感染建立鼠伤寒沙门氏菌感染模型,流式细胞术检测肝脏γδ T细胞的活化与细胞因子的分泌情况。结果1、肝脏γδ T细胞的比例显著高于胸腺、脾脏与淋巴结。γδ T17细胞的比例在胸腺中随着周龄的增加逐渐下降,在脾脏与肝脏中则逐渐升高。胸腺与肝脏中γδ T1细胞的比例与周龄无明显联系,脾脏中随着周龄的增加逐渐下降。2、与野生小鼠相比,无胸腺裸鼠肝脏中γδ T细胞虽然比例明显下降,但仍存在一定数量的γδT细胞,且具有分泌细胞因子的能力；而脾脏中γδT细胞几乎不存在。3、无胸腺裸鼠与野生小鼠肝脏中存在大量T前体细胞DN1与DN2细胞。DN2细胞从小鼠出生后第2周开始在肝脏中逐渐出现,在第4周时其比例达到最高峰。与胸腺DN2细胞相比,肝脏DN2细胞高表达CD117、低表达CD90与CD25。4、成年小鼠肝脏中存在CD24hiCD73+γδT前体细胞,其比例随着周龄增加逐渐升高。成年小鼠肝脏CD24hiCD73+γδ T前体细胞具有较强地分泌细胞因子的能力,高表达CD44、转录因子T-bet与RORγt,低表达CD27。5、通过与OP9-DL1细胞共孵育,肝脏来源的DN1细胞可以发育为γδ T细胞,且比例较胸腺来源的DN1或DN2细胞高。体内过继转输实验显示,肝脏来源的DN2细胞可以发育为γδ T前体细胞与成熟γδT细胞。6、肝脏中γδ T细胞的表型特点是低表达CD27、高表达CD44。成年小鼠肝脏γδT细胞主要为γδ T17细胞,小肠γδT细胞以γδ T1细胞占优势,脾脏或胸腺中无亚群特异性分布。7、在鼠伤寒沙门氏菌感染第3天时,肝脏中γδT细胞分泌IL-17a 的比例已明显升高。在感染第5天时,肝脏中γδ T细胞CD69表达明显升高,且分泌IFN-γ的比例也明显升高。结论1、除小肠与皮肤外,肝脏含有相对丰富的γδ T细胞。2、肝脏中存在γδ T前体细胞,且具有独特表型和功能特点。3、肝脏T前体细胞DN1或DN2细胞具有向γδ T细胞发育的能力。肝脏可能为γδT细胞胸腺外发育分化的场所。4、肝脏γδT细胞具有独特的表型、亚群分布和功能特点。
【关键词】：肝脏 γδT细胞 T前体细胞 胸腺外发育 鼠伤寒杆菌
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 主要符号说明15-17
• 文献综述17-34
• 一、T细胞的发育选择假说17-20
• 1.1 预定向分化假说18-19
• 1.2 信号强度假说19-20
• 二、γδ T细胞亚群的分类20-23
• 2.1 根据TCRγ或δ链的使用进行分类20-21
• 2.2 根据γδT细胞表型进行分类21-22
• 2.3 根据γδT细胞的功能进行分类22-23
• 三、γδT细胞独特的发育调控机制23-27
• 3.1 微环境对γδT细胞发育的影响24
• 3.2 转录因子对γδT细胞发育的调控24-25
• 3.3 γδTCR信号强度对γδT细胞发育的调控25-27
• 参考文献27-34
• 1 前言34-37
• 2 材料和方法37-42
• 2.1 主要实验材料37-39
• 2.2 主要实验试剂的配制与保存39-41
• 2.3 主要实验仪器41-42
• 3 主要实验方法42-48
• 4 实验结果48-75
• 4.1 肝脏含有相对丰富的γδT细胞,可能为γδT细胞胸腺外发育的场所48-53
• 4.2 肝脏存在T前体细胞,且该前体细胞具有不同于胸腺T前体细胞的表型53-59
• 4.3 肝脏存在γδ T前体细胞,且具有独特的表型和功能特点59-65
• 4.4 肝脏T前体细胞向γδ T细胞发育分化的初步验证65-69
• 4.5 肝脏γδT细胞具有独特的表型、亚群分布和功能特点69-75
• 5 讨论75-81
• 6 总结及创新点81-82
• 参考文献82-88
• 攻读学位期间取得的研究成果88-89
• 待发表的论文89-105
• 致谢105-106
• 学位论文评阅及答辩情况表106

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