小鼠甲状腺来源间充质干细胞的生物学特性研究

发布时间：2017-04-05 10:17

  本文关键词：小鼠甲状腺来源间充质干细胞的生物学特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探索小鼠甲状腺来源间充质干细胞的生物学特性,比较其与骨实质来源间充质干细胞是否具有差异,为临床研究自身免疫性甲状腺炎的发病机制提供理论与实验依据。方法:1、采用组织贴壁培养法,体外无菌分离并培养C57BL/6小鼠甲状腺来源间充质干细胞(Thyroid derived Mesenchymal Stem Cells,TMSCs),以小鼠骨实质来源间充质干细胞(Bone essence derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)作对照,通过倒置显微镜观察贴壁细胞形态,然后利用不同诱导剂诱导贴壁细胞向成脂肪、成骨分化,油红O染色检测成脂分化能力,碱性磷酸酶及Von Kossa染色检测成骨分化能力,Q-PCR检测相关成脂肪和成骨关键转录因子的表达。进一步,采用CCK8法检测贴壁细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期。2、在获得小鼠甲状腺来源MSCs的基础上,采用淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test,LTT)和混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)检测MSCs对T细胞增殖的免疫抑制功能。进一步,将甲状腺来源MSCs与DC共培养,倒置显微镜下观察DC形态改变,流式细胞术检测DC表面抗原的表达,Q-PCR法在m RNA水平检测促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-12的表达水平。3、建立异体鼠尾皮瓣移植模型,检测甲状腺来源MSCs体内免疫调节及修复受损组织的能力。将小鼠甲状腺来源MSCs通过尾静脉输注模型小鼠体内,每日观察移植皮瓣炎症反应程度和愈合情况,第7天行病理学检测移植皮瓣组织淋巴细胞浸润程度。结果:1、从小鼠甲状腺和骨实质组织中均可培养出贴壁生长的成纤维样的细胞,流式细胞仪检测相关细胞表型,两种细胞均阳性表达CD29、CD140、CD105和Sca-1,而不表达CD34、CD45、CD31、CD11b和MHCII。进一步,将细胞向脂肪和骨细胞诱导分化,结果显示,细胞可被诱导成脂肪,油红染色可见有大量脂滴出现,Q-PCR检测可见脂肪分化关键转录因子C/EBPα和PPARγ的表达;成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色可见碱性磷酸酶活性增高,Von Kossa染色可见钙化骨结节形成,Q-PCR检测可见成骨关键转录因子Run X2和Osteocalcin的表达,说明成功获得小鼠甲状腺来源MSCs。利用CCK8法检测甲状腺来源MSCs的生长特性,结果显示,细胞呈S型曲线生长,流式细胞术检测细胞周期,可见80%以上细胞分布在G0/G1期,提示获得的贴壁细胞符合干细胞的生长特性。2、在获得TMSCs的基础上,针对MSCs独特的免疫调节功能进行LLT和MLR检测。LTT检测TMSCs对Con A刺激的T淋巴细胞增殖能力的影响,结果表明,TMSCs可有效抑制Con A刺激的T淋巴细胞增殖能力,且随着TMSCs量的增加,其抑制作用显著增强(P0.05);利用异体淋巴细胞刺激的MLR实验也得到相同的实验结果,即MSCs抑制异体淋巴细胞抗原刺激的T细胞增殖能力随着MSCs数量的增加,其抑制作用显著增强(P.05)。3、DC作为抗原递呈细胞,在免疫调节中发挥重要作用,同时MSCs对DC功能也具有重要的调节作用。为此,我们在体外利用MSCs与DC共培养体系,观察甲状腺来源MSCs对DC功能的影响,结果显示,与甲状腺来源MSCs共培养的DC,其形态表现为细胞树状突起少而短;流式细胞仪检测DC细胞表面抗原表达,可见CD11c、CD80、CD86和MHCII表达量均显著下降;Q-PCR检测相关促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-12 m RNA的表达亦显著下降(P0.05)。4、利用小鼠尾部皮瓣移植模型检测甲状腺来源MSCs的体内免疫调节功能和组织修复能力,结果表明,TMSCs与BMSCs相似,具有修复鼠尾皮瓣损伤的能力,皮瓣损伤愈合较对照组快。病理切片结果显示,TMSC治疗小鼠皮瓣组淋巴细胞浸润程度较对照组低,提示TMSCs可有效促进皮瓣损伤愈合,减轻炎症反应。结论:1、成功分离获得小鼠甲状腺来源MSCs,其细胞形态、免疫表型、诱导分化能力和细胞增殖特性均与骨实质来源MSCs相似。2、通过体外LTT和MLR实验结果表明,小鼠TMSCs具有免疫调节能力,在体外可抑制Con A和异种抗原刺激的T淋巴细胞的增殖,且具有明显的剂量依赖性。同时,TMSCs对抗原递呈细胞DC的免疫功能也具有调节作用,可显著抑制DC的成熟。3、体内异体鼠尾皮瓣移植模型实验结果表明,TMSCs可抑制移植术后产生的异体免疫排斥反应,诱导免疫耐受,对受损组织具有较强的修复能力,可以有效减轻炎症反应及淋巴细胞浸润程度。上述研究结果表明,小鼠甲状腺来源MSCs具有与骨实质来源MSCs相似的生物学特性,为今后深入探讨自身免疫性甲状腺炎的发病机制提供可靠的理论和实验依据。
【关键词】：甲状腺来源间充质干细胞 骨实质来源间充质干细胞 生物学特性 免疫调节功能 组织修复能力
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.8
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、小鼠甲状腺来源MSCs的体外分离培养和鉴定16-40
• 1.1 对象和方法17-25
• 1.2 结果25-37
• 1.3 讨论37-39
• 1.4 小结39-40
• 二、小鼠甲状腺来源MSCs的体外免疫调节功能研究40-54
• 2.1 对象和方法41-44
• 2.2 结果44-51
• 2.3 讨论51-53
• 2.4 小结53-54
• 三、小鼠甲状腺来源MSCs的体内免疫调节功能和组织修复能力研究54-59
• 3.1 对象和方法55-56
• 3.2 结果56-57
• 3.3 讨论57-58
• 3.4 小结58-59
• 结论59-60
• 参考文献60-66
• 发表论文和参加科研情况说明66-67
• 综述 间充质干细胞在治疗自身免疫性疾病中的研究进展67-75
• 综述参考文献72-75
• 致谢75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 杨华强;李红;胡明均;李玉玲;覃骏;鲍红霞;吕晓娟;;脐带间充质干细胞辅助治疗难治性类风湿性关节炎的临床观察[J];现代生物医学进展;2014年21期

2 黎阳;魏菁;吴燕峰;王潇娉;黄科;林永潮;黄绍良;方建培;;间充质干细胞对脐血CIK/NK细胞CD69表达及培养体系中T调节细胞量比的影响[J];中国实验血液学杂志;2009年05期

3 杨志宏;上官守琴;杨萍;陆华;王鹏;刘小伟;田诗政;;骨髓基质干细胞移植促进皮瓣缺血再灌注损伤修复的机制初步探讨[J];医学研究杂志;2013年02期

  本文关键词：小鼠甲状腺来源间充质干细胞的生物学特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：286941