乳凝集素改善坏死性小肠结肠炎肠道通透性及损伤修复的研究

发布时间：2017-04-08 11:23

  本文关键词：乳凝集素改善坏死性小肠结肠炎肠道通透性及损伤修复的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:新生儿坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis,NEC)是早产儿常见的消化道进展性疾病,其发病机制不明,但与肠道屏障功能破坏密切相关。课题组前期实验证明,乳凝集素可通过调节肠道紧密连接蛋白,降低大鼠肠道屏障的通透性。本研究拟通过检测乳凝集素对肠道紧密连接蛋白(Claudin-3和Occludin)的表达和分布,及肠道屏障修复相关蛋白(TLR4)表达等的影响,探讨乳凝集素在改善NEC中的作用及可能机制。方法:第一部分动物实验:(1)动物分组:一日龄新生大鼠被分为母乳组(DF组)、NEC模型组(N组)和NEC+rh MFG-E8组(N+M组),采用缺氧冷应激+配方奶侵袭性喂养的方法建立NEC模型,而N+M组在建立NEC模型的基础上予以rh MFG-E8 100μg/天。(2)小肠形态学检查:喂养96h后,处死新生大鼠,并观察肠道外观形态,取小肠回盲部组织,进行组织病理学以及透射电镜检查。(3)肠道通透性检测:各组新生大鼠于喂养结束后予以FITC标记的葡聚糖(FD10S),5h后采血,检测血清中FITC的浓度来评估肠道屏障通透性。(4)肠道紧密连接蛋白表达分布水平检测:通过Western blot、q RT-PCR和免疫组化的方法检测小肠回盲部CLDN3和Occludin的分布情况。(5)肠道TLR4表达水平检测:通过Western blot和q RT-PCR检测小肠回盲部TLR4的表达情况。第二部分细胞实验:(1)细胞分组:将IEC-6细胞分为PBS组(P组,对照组)、LPS组(L组,添加LPS 50μg/ml)和LPS+rh MFG-E8组(L+M组,在LPS组的基础上添加rh MFG-E8 2μg/ml)。(2)细胞通透性检测:利用transwell小室构建单层细胞模型,分组培养24h后上室内添加FD10S,5h后取下室内液体检测FD10S的浓度评价各组细胞通透性。(3)细胞紧密连接蛋白的表达分布水平:细胞分组后培养24h,采取免疫荧光、Western blot和q RT-PCR检查观察CLDN3、Occludin和ZO-1蛋白的表达分布情况。(4)划痕实验:细胞分组后,采取划痕的方法构建模型,记录各组细胞于不同时间点(0h,6h,12h和24h)的迁移距离,评估迁移能力。结果:第一部分动物实验:(1)乳凝集素对NEC新生大鼠临床症状的影响N组的新生大鼠最早出现喂养不耐受(包括胃残余量增加,进奶量下降等)、大便性状改变等症状。添加rh MFG-E8后,与N组相比较,新生大鼠的胃残余量减少,进奶量增加。(2)乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部形态学影响与N组相比较,添加rh MFG-E8的N+M组新生大鼠小肠回盲部轻中度积气,未见节段性黑红色坏死灶,其组织病理学评分及NEC阳性率显著降低(P0.05)。透射电镜下,N组新生大鼠小肠回盲部肠黏膜隐窝部上皮细胞空泡化明显,细胞质呈深色,胞浆浓缩,细胞体积缩小,细胞间结构松散,可见典型凋亡细胞。而N+M组仅见细胞核染色质出现不同程度的积聚,核膜边集,线粒体肿胀。(3)乳凝集素对NEC新生大鼠肠道通透性及CLDN3、Occludin和TLR4表达分布的影响与N组相比较,N+M组新生大鼠肠道通透性显著降低(P0.05),CLDN3胞内分布由胞浆内弥散分布变为在胞膜上浓聚。同时,其小肠回盲部TLR4表达水平较N组显著降低(P0.05)。第二部分细胞实验:(1)乳凝集素对LPS处理后IEC-6细胞通透性和紧密连接蛋白表达分布水平的影响与LPS组相比较,L+M组表观渗透系数(Papp)显著降低(P0.05),趋近P组,其CLDN3的表达水平显著降低(P0.05),同时ZO-1由胞浆内弥散分布变为在胞膜上浓聚表达。(2)乳凝集素对LPS处理后IEC-6细胞迁移能力的影响与LPS组相比较,添加rh MFG-E8的L+M组于给药后12h时间点的水平迁移距离显著增加(P0.05),趋近P组。结论:(1)乳凝集素能够改善NEC新生大鼠小肠回盲部外观形态、组织学评分及超微结构,降低NEC的发生率和严重程度。(2)乳凝集素能使NEC新生大鼠小肠回盲部CLDN3蛋白重新分布,使其在细胞膜上浓聚,同时降低TLR4的表达水平,从而降低肠道通透性,提高肠道损伤修复能力,维持肠道屏障的稳态。(3)乳凝集素能降低LPS处理后的IEC-6细胞CLDN3蛋白表达水平,同时使ZO-1蛋白重新分布,使其在细胞膜上浓聚,从而改善细胞通透性。(4)乳凝集素能增强经LPS处理后IEC-6细胞的迁移能力,从而促进肠上皮细胞修复能力。
【关键词】：坏死性小肠结肠炎 乳凝集素 肠道通透性 紧密连接 迁移
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R722.6
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 中英文缩略词表14-15
• 绪论15-18
• 第一部分 乳凝集素对新生大鼠坏死性小肠结肠炎肠道屏障通透性及损伤修复相关蛋白TLR4的影响18-46
• 1.1 材料和方法18-31
• 1.1.1 实验动物18
• 1.1.2 仪器设备18-19
• 1.1.3 试剂耗材19-20
• 1.1.4 试剂配备20-22
• 1.1.5 实验方法22-31
• 1.1.5.1 重组人乳凝集素的表达和纯化22
• 1.1.5.2 NEC新生大鼠模型的制备22-23
• 1.1.5.3 实验动物分组23-24
• 1.1.5.4 肠道通透性检测24
• 1.1.5.5 动物实验取材24
• 1.1.5.6 新生大鼠小肠回盲部组织形态学分析24-27
• 1.1.5.6.1 新生大鼠小肠回盲部组织HE染色检查24-26
• 1.1.5.6.2 新生大鼠小肠回盲部透射电镜检查26-27
• 1.1.5.7 新生大鼠小肠回盲部免疫组化检查27-28
• 1.1.5.8 新生大鼠小肠回盲部Western blot检测28-30
• 1.1.5.9 新生大鼠小肠回盲部real-time PCR检测30-31
• 1.1.6 统计学分析31
• 1.2 结果31-42
• 1.2.1 乳凝集素对NEC新生大鼠临床症状的影响31
• 1.2.2 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部形态学影响31-35
• 1.2.2.1 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部外观形态的影响31-32
• 1.2.2.2 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部HE染色的影响32-34
• 1.2.2.3 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部超微结构的影响34-35
• 1.2.3 乳凝集素对NEC新生大鼠肠道屏障的影响35-42
• 1.2.3.1 乳凝集素对NEC新生大鼠肠道通透性的影响35
• 1.2.3.2 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部肠道紧密连接蛋白CLDN3和Occludin表达分布的影响35-40
• 1.2.3.2.1 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部紧密连接蛋白CLDN3表达分布的影响35-38
• 1.2.3.2.2 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部紧密连接蛋白Occludin表达分布的影响38-40
• 1.2.3.3 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部TLR4表达的影响40-42
• 1.2.3.3.1 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部TLR4蛋白表达的影响40-41
• 1.2.3.3.2 乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部TLR4 mRNA表达的影响41-42
• 1.3 讨论42-46
• 第二部分 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞屏障通透性及细胞迁移能力的影响46-66
• 2.1 材料和方法46-54
• 2.1.1 仪器设备46-47
• 2.1.2 试剂耗材47-48
• 2.1.3 试剂配备48-50
• 2.1.4 实验方法50-54
• 2.1.4.1 重组人乳凝集素的表达和纯化50
• 2.1.4.2 IEC-6 细胞株的培养传代50
• 2.1.4.3 细胞分组50
• 2.1.4.4 单层IEC-6 细胞通透性检测50-51
• 2.1.4.5 划痕实验51
• 2.1.4.6 细胞Western blot检测51-52
• 2.1.4.7 细胞real-time PCR检测52-53
• 2.1.4.8 细胞免疫荧光检测53-54
• 2.1.5 统计学分析54
• 2.2 结果54-64
• 2.2.1 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞屏障的影响54-63
• 2.2.1.1 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞通透性的影响54-55
• 2.2.1.2 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞紧密连接蛋白CLDN3、Occludin和ZO-1 表达分布的影响55-63
• 2.2.1.2.1 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞紧密连接蛋白CLDN3表达分布的影响55-58
• 2.2.1.2.2 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞紧密连接蛋白Occludin表达分布的影响58-61
• 2.2.1.2.3 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞紧密连接蛋白ZO-1 表达分布的影响61-63
• 2.2.2 乳凝集素对LPS处理后IEC-6 细胞迁移能力的影响63-64
• 2.3 讨论64-66
• 结论66-67
• 参考文献67-71
• 致谢71-73
• 附录一：综述73-84
• 参考文献79-84
• 附录二：已刊文章目录84

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 谢婷;高峻;李兆申;;肠道通透性研究进展[J];国际消化病杂志;2008年02期

2 薛建中;;烧伤后病人肠道通透性立即增加[J];国外医学.创伤与外科基本问题分册;1991年01期

3 ;胆汁郁积性黄疸时肠道通透性增加和粘膜免疫状况的变化[J];国外医学.外科学分册;1998年04期

4 董红林;;肠道通透性试验及其临床意义[J];世界华人消化杂志;2000年05期

5 金希;厉有名;虞朝辉;吕国才;徐磊;金杭斌;;大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成过程中肠道通透性的变化[J];中华消化杂志;2006年08期

6 徐卫华,吴性江,黎介寿;门静脉压力改变对门静脉高压症肠道通透性的影响[J];中华外科杂志;2002年03期

7 李宁,刘放南,李幼生,康健,李福建,黎介寿;腹部手术后患者血浆谷氨酰胺的变化及对肠道通透性的影响[J];肠外与肠内营养;1998年01期

8 吴建浓;朱美飞;雷澍;王灵聪;;电针对脓毒症患者肠道通透性的影响[J];中国针灸;2013年03期

9 胡燕,阳文琳,黎海芪,陈国民,瞿平;采用高效液相色谱法检测儿童肠道通透性的方法学研究[J];中国儿童保健杂志;2005年01期

10 葛姗姗;吴建浓;朱英;郭鑫艳;;不同方法治疗后脓毒症患者的肠道通透性测定及比较[J];中国中医急症;2012年11期

中国重要会议论文全文数据库 前3条

1 金希;厉有名;虞朝辉;吕国才;徐磊;金杭斌;;大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成过程中肠道通透性的变化[A];2007年浙江省消化系疾病学术会议论文汇编[C];2007年

2 宇汝胜;汪昌荣;;烧伤后肠道通透性改变[A];第七届全国烧伤创疡学术会议论文汇编[C];2002年

3 吴炜烽;吕宾;方莉;张烁;;云母对大鼠实验性NSAIDs肠病肠道通透性的影响[A];第二届浙江省消化病学术大会论文汇编[C];2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 曾小斌;益生菌对重症急性胰腺炎肠道通透性改变的实验研究[D];四川医科大学;2015年

2 赵谦;小鼠急性心肌梗死后肠道通透性变化及谷氨酰胺对其影响的研究[D];华北理工大学;2016年

3 雷一慧;乳凝集素改善坏死性小肠结肠炎肠道通透性及损伤修复的研究[D];上海交通大学;2015年

4 樊春华;肠黏膜损伤与肠道通透性的关系及肠炎清对二者影响的研究[D];广州中医药大学;2008年

5 陈丹;1. 肠道通透性HPLC-ELSD检测方法研究 2. 经大孔树脂处理的中药提取物中残留溶剂分析方法研究[D];中国协和医科大学;2007年

6 朱疆依;尿L/M值与尿PEG600测定在评价肠道通透性上的比较研究[D];南方医科大学;2008年

  本文关键词：乳凝集素改善坏死性小肠结肠炎肠道通透性及损伤修复的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：292778