检测五种腹泻相关病毒多重RT-PCR方法的建立和2013年9月～2014年10月广州地区腹泻病原谱调查

发布时间：2017-04-19 17:17

  本文关键词：检测五种腹泻相关病毒多重RT-PCR方法的建立和2013年9月～2014年10月广州地区腹泻病原谱调查，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：据WHO统计,全球每年约有20亿腹泻病例,较差的卫生状况导致发展中国家腹泻更为普遍。2000年至2010年全球儿童死亡病因统计分析,腹泻疾病是继肺炎和围产期疾病之后导致5岁以下儿童死亡的第三大原因[¨。全球腹泻致死率不断下降,但是腹泻发病率仍然很高。在发展中国家,腹泻仍然是引起死亡和伤残的主要原因之一[2]。在我国,感染性腹泻在法定传染病中报告发病率位居前3位。作为公共卫生问题之一的感染性腹泻仍然是一类全球性的、危害很大的疾病,不可掉以轻心。建立快速检测和筛查腹泻病原谱的方法,研究腹泻病病原体的种类和流行病学,将有助于控制腹泻病原体在全球范围内的流行与传播。腹泻的定义为每日排便3次或以上,且大便性状有改变(呈稀便、水样便、粘脓便或脓血便等),可伴有呕吐、发热和呼吸道症状等临床症状。腹泻病因复杂,可分为感染性腹泻和非感染性腹泻。与感染性腹泻相关的病原体种类繁多,包括多种细菌、病毒、寄生虫和真菌,其中以前两类病原体最为常见。常见细菌感染性腹泻病原体有致病性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、沙门氏菌、弯曲菌、志贺氏菌、霍乱弧菌和艰难梭菌等；常见病毒感染性腹泻病原体有轮状病毒、诺如病毒G Ⅰ/GⅡ型、星状病毒、腺病毒40/41型和札如病毒等。早期、快速、高通量及特异灵敏的实验室检测技术对腹泻病原体的鉴定、临床诊断与正确用药、尽快控制病情及流行病学研究均极为重要。腹泻病原体检测方法中,经典的病原体检测技术为分离培养技术。细菌、病毒的分离,培养周期长,不同细菌、病毒所需培养条件不同,操作繁琐,对技术人员要求高,某些病毒目前没有合适的培养方法；免疫学检测技术,包括乳胶凝集试验、酶免疫测定、放射免疫测定、免疫胶体金法,免疫层析法等,已广泛应用于临床检测中,但其对特异性单克隆抗体准确识别的严格要求及多数体系缺少集成性等限制了诊断的快速与高通量；分子生物学方法,能更准确、灵敏地检测标本中的病毒核酸,尤其是低浓度的病毒感染,最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究,不会受到制备分型单克隆抗体的限制,对流行病学研究具有重要意义。上述的方法中,分子生物学检测方法,其在灵敏度和特异性方面具有明显的优势。并且,随着基因芯片技术的逐渐成熟,由简单的单一反应只能扩增并检测一种核酸的PCR方法,逐渐发展为一次反应能扩增并检测多种病原体核酸的多重RT-PCR方法。因此,利用一种特异、灵敏、高通量的检测方法,以最大程度覆盖检测腹泻病原体,将为腹泻疾病的临床治疗和流行病学研究提供有效的参考。本研究包括以下三个部分：一、2013年9月～2014年10月广州地区腹泻病原谱调查腹泻病因复杂,其中与感染性腹泻相关病原体种类繁多,包括细菌、病毒和寄生虫三大类。每类病原体包含了众多的常见致病菌／病毒,例如沙门氏菌、弯曲菌、轮状病毒和诺如病毒。对于腹泻病因的诊断,依赖于临床实验室对腹泻粪便标本的检测。目前临床常规检测方法有细菌培养、病毒免疫胶体金法检测和寄生虫镜检,较少使用分子生物学方法。检测存在耗时长,灵敏度和特异性不理想等缺点。而目前国内外对于腹泻病因的调查,由于检测方法的局限,多集中于病毒或细菌某一类病原体的检测报道。另外,据《广州经济社会白皮书》报道,广州于2013年底成为中国继重庆、上海、北京和天津之后第五个千万人口规模的城市。对于一个常住人口数巨大的城市而言,腹泻暴发流行将会给社会经济发展带来重大的负担。同时,广州地区对于腹泻病因的研究尚不够充分。因此,采用先进的方法对本地区腹泻病因进行监控是十分有必要的。我们收集了广州市海珠区珠江医院从2013年9月至2014年10月,共289份门诊/住院腹泻患者的粪便标本,采用基于液相悬浮芯片技术的xTAGGastrointestinal Pathogen Panel (xTAG GPP)试剂盒检测腹泻粪便标本。该试剂盒覆盖检测15种病原体,包括9种细菌(弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、艰难梭菌毒素A/B、霍乱弧菌、0157型大肠杆菌、产志贺样毒素大肠杆菌、肠毒素型大肠杆菌)、3种病毒(A组轮状病毒、诺如病毒G I型和GⅡ型、腺病毒40/41型)和3种寄生虫(隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、溶组织阿米巴)。并且,能在5小时内得到检测结果,实现了腹泻病因的快速准确诊断。通过xTAG GPP的检测结果,分析广州地区腹泻病原谱构成、病毒性病原优势流行株、细菌性/病毒性病原流行季节等情况。本研究中,总样本阳性率为74.4%(215/289)。其中,细菌性腹泻占47.4%,病毒性腹泻占35.0%。细菌性腹泻以沙门氏菌、弯曲菌和艰难梭菌感染为主,占89.0%；病毒性腹泻以轮状病毒、诺如病毒GII型感染为主,占92.1%。各种病原体检测结果与临床流行病学因素的统计学分析表明,细菌性腹泻全年均可发生,呈炎热季节高发的特点,易感年龄段分布不明确；而病毒性腹泻有明显寒冷季节高发和1-3岁年龄段易感的特点。在临床症状的差异上,细菌性腹泻更容易出现粪便白细胞/红细胞/隐血试验阳性,而病毒性腹泻更容易发生呕吐等并发症。另外,对于病毒检测阳性的标本,进行基因分型研究。G2P[8]型轮状病毒、GⅡ.4型诺如病毒为优势流行株。本研究中腹泻病原体呈现的流行病学特征与目前国内外相关流行病学调查结果相符。二、检测五种腹泻相关病毒多重RT-PCR方法的建立腹泻病因的诊断对于临床治疗的开展与正确用药至关重要。区分细菌性腹泻和病毒性腹泻,能有效提高临床治疗效果、避免滥用抗生素和给患者带来不必要的经济损失。临床实验室对于细菌性腹泻的检测,常规方法为腹泻粪便培养。细菌培养耗时长(约3～5天时间),且对操作人员的实验技术要求较高。临床实验室对于病毒性腹泻的检测,常规方法为免疫胶体金法。免疫法快速简便,但是特异性和灵敏度尚不理想,且覆盖病毒性病原谱有限,容易造成漏诊。基于液相悬浮芯片技术的xTAG GPP,具有灵敏、特异、高通量的多重检测功能。但由于其价格昂贵,临床实验室无法常规开展。因此,我们想建立一种检测病毒性腹泻常见病原的多重RT-PCR方法,实现临床实验室对病毒性腹泻的快速准确诊断,或者结合免疫胶体金法检测结果以最大可能排除病毒性腹泻。建立的多重RT-PCR检测可涵盖的病原体包括——诺如病毒G Ⅰ型和G Ⅱ型、腺病毒、星状病毒和札如病毒。选择文献报道的引物,进行引物最佳退火温度的优化。通过对RT-PCR反应体系中各物质相对比例的调整,选择最佳的体系配置建立多重RT-PCR。利用轮状病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、沙门菌、志贺菌、弯曲菌、艰难梭菌、O157型大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌和嗜水气单胞菌的菌(毒)株等非靶病毒核酸,进行特异性验证。构建五种病毒质粒,倍比稀释后进行RT-PCR和多重RT-PCR对于靶病毒的检测限实验和灵敏度比较。利用多重RT-PCR和多重检测液相悬浮芯片试剂盒xTAGGPP、RT-PCR平行检测107份标本。因xTAG GPP不包含多重RT-PCR可检测的星状病毒和札如病毒,其检测以RT-PCR为参考,以后两者为参考方法评估多重RT-PCR对五种腹泻相关病毒的检测灵敏度、特异性以及与两种方法的吻合度。研究结果表明,建立的多重RT-PCR方法与液相悬浮芯片、RT-PCR的检测吻合度高,κ值分别为0.885和1.0。以液相悬浮芯片为标准,多重RT-PCR检测灵敏度为80.8%,特异度为100%。多重RT-PCR对五种病毒的检测限为104copies/μL-106copies/μL。三、广州地区2013-2014年星状病毒和札如病毒感染性腹泻基因型分析病毒性腹泻的常见病原包括轮状病毒、诺如病毒G Ⅰ型和G Ⅱ型、腺病毒40/41型、星状病毒和札如病毒。目前,国内外对于轮状病毒、腺病毒和诺如病毒感染均有详尽的流行病学调查资料。由于星状病毒和札如病毒检出率较低,两者的流行病学报道尚不够详细。人星状病毒(Human astrovirus, HAstV)属于星状病毒科哺乳动物星状病毒属。病毒基因为单股正链RNA,基因组全长约7.0kb,全基因组有3个开放阅读框(ORF)。根据衣壳蛋白的编码基因可以将星状病毒分为8个经典基因型(HAstV——1～8)。札如病毒(Sapovirus, SaV)与诺如病毒同属于杯状病毒科,其为单股正链RNA病毒,基因组全长约7.5kb,含有2个ORF。根据VP1序列,札如病毒至少可以分为5个基因型(G Ⅰ～GV)。GⅠ型、GⅠ型、GⅣ型和GⅤ型主要感染人,而GⅢ型主要感染动物。本研究的目的是了解广州地区腹泻患者中星状病毒和札如病毒感染的流行情况,分析其基因型特征。利用实验室建立的多重RT-PCR方法检测星状病毒、札如病毒、诺如病毒GI型/GII型和腺病毒。对于星状病毒和札如病毒检测阳性的标本进行测序比对,构建进化树,分析优势流行亚型。收集2013年10月-2014年9月广州市海珠区珠江医院门诊和住院病人腹泻粪便样本,提取粪便标本核酸,进行多重RT-PCR检测。检测结果显示,273份粪便样本中,星状病毒阳性率为3.3%(9/273),检出基因型为星状病毒1型、2型、4型和8型。札如病毒阳性率为1.5%(4/273),基因型均为札如病毒G Ⅰ型。综上,对2013年9月～2014年10月广州地区腹泻病例信息和标本的收集,并利用液相悬浮芯片试剂盒xTAG GPP检测15种腹泻相关病原体,初步得到广州地区腹泻病原谱构成情况。对多重RT-PCR的临床应用评估表明,多重RT-PCR与液相悬浮芯片xTAG GPP对于临床标本检测一致性好,可望成为高通量、快速、特异、灵敏适用于临床微生物实验室常见腹泻相关病毒的多重检测工具。利用建立的多重RT-PCR对广州地区2013-2014年星状病毒和札如病毒感染性腹泻基因型分析,提示星状病毒和札如病毒是引起人类腹泻的重要病原体。
【关键词】：腹泻 液相悬浮芯片技术 多重RT-PCR 病毒 细菌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R725.7
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-22
• 第一章 2013年9月～2014年10月广州地区腹泻病原谱调查22-39
• 1.1 材料和方法22-29
• 1.2 结果29-35
• 1.3 讨论35-38
• 1.4 小结38-39
• 第二章 检测五种腹泻相关病毒多重RT-PCR方法的建立39-62
• 2.1 材料和方法39-54
• 2.2 结果54-60
• 2.3 讨论60-61
• 2.4 小结61-62
• 第三章 广州地区2013-2014年星状病毒和札如病毒感染性腹泻基因型分析62-72
• 3.1 材料与方法62-65
• 3.2 实验与结果65-70
• 3.3 讨论70-71
• 3.4 小结71-72
• 全文总结72-73
• 参考文献73-78
• 缩略词简表78-79
• 致谢79-80
• 硕士研究生期间发表论文80-81

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