EV71感染相关miRNA筛选及FNC抗EV71活性研究

发布时间：2017-04-29 21:06

  本文关键词：EV71感染相关miRNA筛选及FNC抗EV71活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：手足口病被列为我国法定丙类传染病,其发病率和死亡率在丙类传染病中居首,已成为严重危害婴幼儿健康和公共卫生安全的重要传染病。感染手足口病的病原体有:肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A组(Coxasckievirus A group,CVA)和柯萨奇病毒B组(Coxasckievirus B group,CVB),以EV71和CVA16最为常见。EV71除了引起手、足、口和粘膜部位出现疱疹以及发热外,还会出现无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、心肌炎、急性弛缓性麻痹等疾病[1],特别是一些重症患儿发展比较迅速易出现死亡。该病毒主要感染婴幼儿,尤其是6岁以下的儿童。目前临床上尚无特效的抗EV71药物,只能是对症疗法。EV71动物感染模型的缺乏严重阻碍了肠道病毒71型治疗药物及抗病毒靶标研究。目的获得EV71乳鼠适应株,建立EV71感染乳鼠模型,为抗EV71药物的筛选和活性评价提供稳定可靠的动物模型;研究EV71感染相关宿主miRNA,为EV71感染防治提供潜在新型抗病毒药物靶标,并为研究宿主抗EV71防御机制提供更为深层次的理解;研究核苷类小分子药物FNC对EV71复制的抑制作用,并初步探讨其抗病毒作用机制,为EV71病毒感染的预防和治疗提供先导化合物或候选药物。方法1)EV71(BrCr)株病毒通过在1日龄ICR乳鼠上连续传代8次,建立EV71(BrCr)株动物适应株模型;通过对各适应株病毒RNA拷贝数的测定和乳鼠感染各病毒适应株后死亡率计算观察各适应株的毒力增减情况;通过对适应株病毒的全基因测序比对突变位点;通过在Vero细胞上大量扩增EV71(H)株病毒,用腹腔注射的方法感染12日ICR乳鼠建立EV71(H)株动物模型。2)应用生物信息学方法筛选预测EV71感染相关宿主miRNA,应用荧光定量PCR方法检测预测出来的宿主miRNA在EV71感染前后的表达变化,合成制备相应宿主miRNA inhibitor,转染细胞后感染病毒,通过CPE法、空斑法、荧光定量PCR法、免疫荧光和免疫印迹的方法测定相应miRNA抑制剂对EV71病毒的抑制作用。3)CCK8法筛选出具有抗EV71病毒活性的药物;通过CCK8法测定FNC在Vero细胞和RD细胞上的细胞毒性和对EV71感染致细胞病变的抑制作用,通过免疫荧光法、空斑形成法及免疫印迹法检测FNC对EV71感染细胞后上清液中病毒滴度的影响和细胞中VP1蛋白表达的影响;进一步机制研究,检测FNC对EV71病毒的直接灭活作用、EV71病毒生活周期的影响及3C蛋白酶活性的影响;病毒在RD细胞上连续传代14次同时给予FNC抑制病毒,检测EV71对FNC的耐药性。结果1)成功建立了EV71(BrCr)株动物模型,且随着适应代数的增加毒力有所加强,感染P8-1J-V病毒后能使7日龄ICR和BALB/c乳鼠死亡率达到100%;通过对P8-1J-V全基因测序发现有4个位点发生了突变(1819:C→T;2428:C→G;2731:A→G;5259:G→A);成功建立EV71(H)株动物模型,且不论是病毒原液还是病毒5倍稀释液感染12日龄ICR乳鼠后死亡率均达到70%以上。2)经生物信息学方法预测,hsa-miR-146a-5p、hsa-mi R-155-5p、hsa-miR-210可能与EV71复制相关。荧光定量PCR法检测发现,随着感染时间的增加感染EV71病毒后hsa-mi R-146a、hsa-miR-155、hsa-miR-210的表达量逐渐增加。转染相应的miRNA抑制剂能抑制EV71病毒导致的细胞病变,减少培养液中EV71病毒的病毒滴度和病毒RNA的拷贝数,减少EV71病毒VP1蛋白的表达。3)筛药实验发现FNC具有抗EV71病毒活性;FNC抑制EV71致细胞病变,病毒梯度稀释(MOI分别为10、1和0.1)后感染RD和Vero细胞,其IC50值分别为(88.40±17.99)、(66.07±5.27)、(33.76±4.65)nM;(10.16±2.46)、(12.08±2.07)、(6.40±2.317)nM;FNC能显著降低病毒感染后上清中病毒滴度和细胞中VP1蛋白的表达。机制研究发现,FNC无直接杀病毒作用;FNC对病毒生活周期的复制阶段作用较明显(P0.05);0.33g/mL的FNC对3C蛋白酶的活性有微弱的抑制作用。耐药性实验发现,200、100nM的FNC连续14次抑制病毒后对EV71致细胞病变作用未见明显变化。结论初步建立了EV71(BrCr)株和EV71(H)株手足口病乳鼠动物模型;hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-210表达与EV71病毒感染相关,抑制hsa-miR-146a、hsa-mi R-155、hsa-miR-210的表达具有抑制EV71病毒复制的作用,hsa-miR-146a、hsa-miR-155、hsa-miR-210可能发展成为新型抗EV71病毒药物靶标;FNC具有抗EV71病毒活性,其作用机制可能是通过抑制病毒的复制达到抗病毒作用
【关键词】：肠道病毒71型 动物模型 miRNA FNC 机制
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACTS10-13
• 前言13-16
• 第一部分 肠道病毒71型（EV71）感染乳鼠模型的建立16-29
• 材料与方法16-23
• 1 实验材料16-17
• 2 实验方法17-23
• 结果23-29
• 1 EV71(BrCr)株感染乳鼠模型的建立23-27
• 2 EV71(H) 株感染乳鼠模型的建立27-28
• 3 P8-1J-V病毒适应株的序列测定28-29
• 第二部分 抗EV71药物靶标的筛选和验证29-41
• 材料与方法29-36
• 1 实验材料29-30
• 2 实验方法30-36
• 结果36-41
• 1 靶向EV71感染宿主miRNA的预测36
• 2 RD细胞感染EV71病毒后miRNA的表达变化检测36-38
• 3 miRNA抑制剂对EV71感染RD细胞的影响38-41
• 第三部分FNC抗肠道病毒71活性及作用机制研究41-61
• 材料与方法41-48
• 1 实验材料41-42
• 2 实验方法42-48
• 结果48-61
• 1 FNC抗病毒活性研究48-53
• 2 FNC抗病毒机制研究53-59
• 3 耐药性实验59-61
• 讨论61-64
• 结论64-65
• 参考文献65-70
• 致谢70-71
• 附录一 附表71-73
• 附录二 文献综述73-80
• 参考文献77-80
• 附录三 在校期间论文论著情况和科研情况80

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 严小虎;常山;田家亮;;RNA干扰治疗新进展[J];西南军医;2008年04期

2 黄维金;梁争论;;肠道病毒71型研究进展[J];微生物学免疫学进展;2009年02期

3 秦咸蕴;林霖;杨燕;张书香;孔建强;程克棣;赵云峰;王伟;;EV71非结构蛋白的结构和功能及其为靶点的药物研究进展[J];药学学报;2011年07期

4 何静;周志统;袁正宏;胡芸文;;抗肠道病毒71型药物研究进展[J];医学综述;2011年09期

5 刘艳宁;楼国华;陈智;;基于RNA干扰技术和microRNA调控的丙型肝炎治疗研究进展[J];浙江大学学报(医学版);2011年06期

6 杜玉琳;张建丽;;银翘散去牛蒡子加杏仁滑石方合季德胜蛇药治疗小儿手足口病22例[J];浙江中医杂志;2009年05期

7 陈永宏;徐辉;桂金贵;;注射用双黄连治疗小儿手足口病临床观察[J];中国中西医结合急救杂志;2006年01期

  本文关键词：EV71感染相关miRNA筛选及FNC抗EV71活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：335605