骨髓间充质干细胞对幼鼠慢性肾功能不全的修复作用

发布时间：2017-05-06 19:02

  本文关键词：骨髓间充质干细胞对幼鼠慢性肾功能不全的修复作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨同种异体骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)移植对幼鼠慢性肾功能不全(Chronic Renal Insufficiency,CRI)的修复作用。方法:1、骨髓间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及标记:取体质量为40~60g雄性Wistar幼鼠,3%水合氯醛麻醉后断颈处死,75%酒精浸泡消毒15分钟,待酒精滴沥片刻,置于无菌手术弯盘中分离出全骨髓,用全骨髓培养法结合密度离心法培养种子细胞BMSCs,取生长状态良好的第三代BMSCs,用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)检测CD45抗原和CD90抗原阳性表达情况;用成脂诱导分化培养液及成骨诱导分化培养液诱导BMSCs向脂肪细胞及成骨细胞分化,鉴定其多向分化潜能;用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记BMSCs。2、实验动物分组及造模:取体质量为91±12g、生长状况良好的雄性Wistar幼鼠90只,随机为3组:A组:BMSCs治疗组,35只;B组:模型组,35只;C组:正常对照组,20只。A、B两组幼鼠每日同一时间点给予腺嘌呤100mg/(kg?d)灌胃,建立幼鼠CRI模型。C组幼鼠灌胃予等体积蒸馏水作为对照。上述处理共5周。3、BMSCs修复幼鼠CRI:造模24小时,所有幼鼠尾部用医用酒精棉球消毒,可见皮下血管明显扩张,作如下处理:A组幼鼠用留置针抽取1ml DAPI-BMSCs(1x106)经扩张的尾静脉植入;B、C两组幼鼠用留置针抽取1ml PBS缓冲液,经幼鼠扩张尾静脉植入。于治疗后第3天、7天、14天、28天、42天时,从A、B两组幼鼠中随机抽取6只,C组幼鼠随机抽取3只,3%水合氯醛麻醉,颈静脉取血标本,检测肾功能变化血清学指标;放入代谢笼留取24小时尿标本进行尿蛋白定量检测;肾脏组织经中性甲醛固定后,制造切片行HE和PAS染色,记录三组幼鼠切片组织学变化。结果:1、骨髓间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及标记:第三代BMSCs为排列均匀、包体中间粗、两端较细的纺锤形;FCM多次检测显示BMSCs表面CD90抗原阳性,CD45抗原阴性;成脂及成骨诱导分化后,经相应染色分别可见红色脂滴及红色钙化结节形成;DAPI标记种子细胞核为圆形,发蓝色荧光,标记率接近100%。2、CRI模型建立:A、B两组大鼠给予腺嘌呤100mg/(kg?d)连续灌胃5周时,与C组大鼠相比,表现为对外来刺激反应明显迟钝,无精打采,饮食量明显低于C组,尿量多,毛发干枯脱落。随机抽取各组幼鼠3只,留取血、尿标本检测肾功能变化指标(BUN、Cr、尿蛋白定量),均较C组明显升高,P0.05,造模成功。3、BMSCs修复幼鼠慢CRI:肾脏功能学变化:细胞移植治疗28天时,A、B两组间血清肾脏功能学指标无明显差别;42天时,A组上述指标较B组降低,P0.05,结果有统计学意义。肾脏组织学变化:细胞移植治疗28天时,A、B两组大鼠肾组织无明显差别,肾小球主要表现为体积肥大,球囊扩张,炎细胞浸润;肾小管损伤严重,主要表现为轮廓不清,管间排列紊乱,管腔及间质大量淡黄色尿酸结晶沉积,肾小管上皮细胞肿胀、裂解、坏死,间质炎症细胞浸润明显;未见局部肾小球硬化及间质纤维化;42天时,A组肾小管轮廓较B组清晰、规则,尿酸结晶沉积减少,上皮细胞肿胀减轻,炎症细胞浸润减少,P0.05,结果有统计学意义。结论:1、采用全骨髓培养法结合密度离心法可培养干细胞特性保持较为完整的BMSCs细胞。2、CD45和CD90抗原可作为离体培养BMSCs的独立鉴定方法,该法操作简单,结果肯定。经多向诱导分化补充鉴定明确所培养细胞为种子细胞BMSCs;3、100mg/(kg?d)剂量的腺嘌呤每日灌胃,连续5周可成功建立幼鼠慢性肾功能不全模型;4、骨髓间充质干细胞可改善幼鼠慢性肾功能不全,修复受损肾小管,抑制炎症细胞浸润。
【关键词】：慢性肾功能不全 幼鼠 骨髓间充质干细胞 修复
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R726.9
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-12
• 前言12-13
• 1 材料与方法13-20
• 1.1 实验动物13-14
• 1.2 主要实验试剂及仪器14-15
• 1.3 骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及体外标记15-17
• 1.4 腺嘌呤灌胃建立幼鼠慢性肾功能不全模型17
• 1.5 骨髓间充质干细胞移植修复幼鼠慢性肾功能不全17-18
• 1.6 血、尿标本及肾脏组织形态学检测18-19
• 1.7 主要观察指标19-20
• 2 结果20-27
• 2.1 骨髓间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及标记20-23
• 2.2 腺嘌呤灌胃建立幼鼠慢性肾功能不全模型23-24
• 2.3 骨髓间充质干细胞移植修复幼鼠慢性肾功能不全24-27
• 3 讨论27-31
• 4 结论31-32
• 参考文献32-35
• 综述35-40
• 参考文献38-40
• 致谢40-41
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果41-42
• 个人简历42

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