特发性中枢性性早熟女童雌激素受体α基因Pvu Ⅱ和Xba Ⅰ多态性分析与血清骨形成标志物的研究

发布时间：2017-05-26 04:09

  本文关键词：特发性中枢性性早熟女童雌激素受体α基因Pvu Ⅱ和Xba Ⅰ多态性分析与血清骨形成标志物的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1研究背景和目的1.1研究背景女童在8岁前,男童在9岁前出现第二性征即定义为性早熟,可分为中枢性性早熟(central precocious puberty,CPP)、不完全性或部分性性早熟、外周性性早熟三类,特发性中枢性性早熟(idiopathic central precocious puberty,ICPP)是下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)轴的提前启动导致骨骺提前融合、造成终身高不足,但具体作用机制尚未明了。近年各地调查显示性早熟发生率不断升高,已上升至小儿内分泌疾病的第2位,仅次于肥胖症,90%以上为女童。青春发育年龄在过去一个世纪中呈现不断提前的趋势,乳腺发育年龄仍在提前,初潮年龄提前的趋势在20世纪中叶以后已经变缓或停滞。近期美国调查表明,在7周岁时有6.7%的白种女性儿童和27.3%的非裔女性儿童出现乳房发育和阴毛；中国九大城市女童的调查也显示,8岁前出现乳房发育者超过10%,10岁组有1.65%的女性儿童出现初潮。青春期发育与HPGA轴功能的启动相关,各种环境因素如环境内分泌干扰物、雌激素对食物、水源等污染,生活方式的改变,跨国收养儿童及营养过剩所致肥胖等,均可通过影响HPGA轴的启动与功能,甚至通过对基因的影响而导致性早熟的发生。雌激素受体a(estrogen receptor,ER)在雌性个体第二性征发育和繁殖周期的维持及影响繁殖力方面发挥关键作用。在ERa基因上游存在多种多态性位点,目前报道ERa基因多态性有2000多种,其中PvuII(rs2234693)和XbaⅠ (rs9340799)限制性片段长度多态性受到广泛关注。这2处点突变位于ERa基因第1内含子内距第2外显子上游约351kb和397kb两处,正好发生在限制性内切酶XbaⅠ和PvuⅡ识别位点上,PvuⅡ的T/C等位基因标记为p/P,XbaⅠ的A/G等位基因标记为x/X,其中P和X分别为缺乏PvuⅡ和XbaⅠ酶切位点的突变基因型。不同的基因型有可能影响不同个体之间ER的表达水平与功能差异,从而影响体内雌激素生理作用。目前已有研究指出ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性与多种激素相关性疾病相关,如乳腺癌、妇科肿瘤、骨质疏松等[6],国内外有少量报道ER多态性与性早熟的发生有关,结论尚不统一。本研究拟检测ICPP女童ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性,探讨ERa基因PvuⅡ、XbaⅠ多态性与中枢性性早熟的关系,为进一步深入研究提供一定理论依据。中枢性性早熟是性腺提前发育同时伴有生长加速的一类生长发育疾病,体内骨代谢旺盛,采用骨代谢检测指标探讨骨骼生长发育的研究日益增多。经典的骨形成特异性标志物包括血钙、磷、碱性磷酸酶等,但存在敏感性低、特异性不高等缺点。现代的反映成骨活性的特异性标志物包括：Ⅰ-型前胶原羧基端前肽、骨型碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BAP)、骨钙素(osteocalcin,OC)等,弥补了经典骨形成标志物的不足,测定这些产物可了解成骨细胞的功能状态,已广泛应用于成人骨骼疾病的诊断、疗效监测及发病机制的研究。C型利钠肽氨基末端(amino-terminalpro-C-type natriuretic peptide,NT-proCNP)是C型利钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)前体蛋白的催化裂解的一种稳定产物,CNP是利钠肽家族其中一员,利钠肽家族主要包括三种结构相关蛋白,分别为心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)和CNP。ANP和BNP主要分布在心血管系统中,而CNP主要存在于心外组织,如中枢神经系统、肌肉骨骼系统。与旁分泌因子的作用方式一致,CNP在调节生长板软骨细胞的增殖分化和细胞外基质合成中发挥着重要的作用,然而,CNP在血浆中浓度很低,一般生化检测手段很难检测到,生理与病理之间浓度变化很小,这限制了它在临床上的应用。NT-proCNP在体内无生物活性,血浆浓度约为CNP的10-50倍,与CNP等摩尔产生,可更好地反映肾功能正常情况下组织CNP的合成。有研究指出NT-proCNP与骨骼生长有关,目前有关骨形成标志物与性早熟关系的研究较少,尤其是NT-proCNP研究甚少,如骨钙素(OC)、骨型碱性磷酸酶(BAP)及NT-proCNP与骨骼生长、性早熟之间的关系已逐渐受到生物学家和儿科内分泌医生的关注。本研究通过测定ICPP女童血清骨钙素、骨型碱性磷酸酶及NT-proCNP等骨形成标志物的水平,同时探讨ERa基因多态性对骨形成标志物的影响,以期对ICPP女童的评估提供一个良好的观察指标。1.2研究目的通过观察特发性中枢性性早熟女童ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性,探讨其与中枢性性早熟发病的关系；测定ICPP女童血清骨钙素、骨型碱性磷酸酶及NT-proCNP等骨形成标志物的水平,探讨ERα基因多态性对骨形成标志物的影响,以期对ICPP女童的诊断和评估提供有用的分子生物学和生化观察指标。2.材料与方法2.1研究对象选取2013年1月至2014年08月在深圳市妇幼保健院儿科内分泌门诊及住院的ICPP女童100例,初诊年龄4～10.5岁,平均(6.690±1.580)岁,所有患儿经详细询问病史、体格检查、测定甲状腺功能、肝肾功能、垂体MRI(平扫+增强)、盆腔(子宫、卵巢)、肝脏和肾上腺彩超及骨龄等检查,经过促性腺激素释放激素(GnRH)激发试验均符合ICPP的诊断标准,同时排除因误服避孕药等引起的外周性性早熟,排除颅内及盆腔、肝脏、肾上腺等部位的占位病变和其他内分泌疾病,如McCune-Albright综合征等引起的性早熟,同时随机选择同一时期在我院体检的健康女童100例为对照组,均未出现第二性征,生长发育正常,无慢性消耗性疾病,年龄在3.83～10.00岁,平均(5.81±1.12)岁,年龄的差异在两组间无统计学意义(t=0.87,P0.05)。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。2.2实验方法(1)收集ICPP女童和正常健康对照组儿童肘静脉血各6ml,其中3ml血用于分离血清后检测血清骨形成标志物水平；另3ml静脉血以待检测ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性。(2)采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测两组女童ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ限制性片段长度多态性,检测ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ的基因型分布及P等位基因和X等位基因的基因频率。(3)采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定ICPP女童及正常对照组女童血清骨形成标志物及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)含量,采用美国Beckman公司生产的Unicel DXI80全自动荧光免疫分析系统测定黄体生成素(LH)、促卵泡素(FSH),雌二醇(E2)等。(4)采用SPSS 13.0软件进行统计学数据分析,用χ2检验检测病例组与对照组基因型频率的分布情况,同时分析基因型之间的交互作用；计算OR值和95%CI,以表示它们之间关联强度；计量资料以(X±s)表示,呈正态分布的数据组间比较采用t检验,呈非正态分布的用非参数t检验,多组间的计量资料比较采用协方差分析(ANCOVA)控制协变量,数据符合正态分布且方差齐多组间的比较采用单因素分析,非正态分布或(和)方差不齐者采用Kruskal-Wills H检验。两两比较方差齐采用LSD检验,不齐者用非参数检验的Dunnett T3检验。以P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1 PvuⅡ多态性分析PvuⅡ基因型及P等位基因频率在两组中分布差异均有统计学意义(χ2=9.023,P=0.011；χ2=6.938,P=0.011),在ICPP组中,P等位基因频率为40.5%,正常对照组中则为28.0%,OR值是1.750(95%CI1.152-2.659,P0.05)：基因型分布上ICPP组和对照组种分别是Pp基因型与pp基因型所占比例较高,各占特定人群的55%和53%。3.2 XbaI多态性分析XbaⅠ基因型及X等位基因频率在两组中分布差异均有统计学意义(x2=11.740,P=0.003；x2=11.408,=0.001)；在ICPP组中,X等位基因频率为42.0%,正常对照组中则为26.5%,OR值是2.061(95%CI1.152-2.659,P0.05),在ICPP组和对照组种分别是Xx基因型与xx基因型所占比例较高,各占特定人群的48%和58%。3.3 PvuⅡ和XbaI多态性组合分析：9种单体型分布经卡方检验在两组间差异有统计学意义(x2=31.388,P=0.001),ICPP组PpXX基因型构成比(13%)高于对照组构成比(3%),而ppxx基因型构成比(11%)低于对照组(39%)。3.4 ICPP组血清骨钙素、骨型碱性磷酸酶、NT-proCNP及IGF-1水平高于正常对照组。血清NT-proCNP与IGF-1水平分别在在Tanner Ⅱ期和Tanner Ⅳ期最高(P0.05),骨钙素与骨型碱性磷酸酶水平均以Tanner Ⅲ期最高,但差异缺乏统计学意义。3.5 ICPP女童的ROC曲线特征显示,血清骨形成标志物含量对中枢性性早熟有一定的诊断价值,其中血清IGF-1的敏感度及特异度较NT-proCNP、OC与BAP为高。3.6 在PvuⅡ基因型分布中,Pp基因型血清NT-proCNP水平高于pp基因型(P=0.011),BAP, OC, IGF-1各基因型中差异无统计学意义；血清NT-proCNP、 BAP、OC、及IGF-1水平在XbaⅠ各基因型中差异均无统计学意义(P0.05)。4结论4.1 ERa基因PvuII和XbaⅠ位点多态性与特发性中枢性性早熟可能有关,携带PvuⅡ的P等位基因发生ICPP的相对风险是p的1.750倍(95%CI：1.152-2.659,P0.05);携带XbaⅠ的X等位基因发生ICPP的相对风险是x的2.061倍(95%CI：1.351-3.145,P0.05),P等位基因和X等位基因可能是ICPP女童遗传易感性基因,Pp基因型或Xx基因型易于患病,PpXX基因型可能是影响中枢性性早熟的潜在危险因素。4.2 ICPP女童血清骨钙素、骨型碱性磷酸酶、NT-proCNP及IGF-1水平增高,血清NT-proCNP与IGF-1水平分别在在Tanner Ⅱ期和Tanner Ⅳ期最高(P0.05),骨钙素与骨型碱性磷酸酶水平均以Tanner Ⅲ期最高,但差异缺乏统计学意义。4.3血清骨形成标志物及IGF-1水平对中枢性性早熟均都有一定的诊断价值,其敏感度及特异度不一,血清IGF-1较NT-proCNP、OC与BAP其敏感度及特异度较高。4.4血清NT-proCNP水平在Pp基因型中的分布高于pp基因型(P=0.011),BAP, OC及IGF-1在PvuⅡ各基因型分布中差异无统计学意义；NT-proCNP、 BAP、OC、及IGF-1在XbaⅠ各基因型分布中差异无统计学意义(P0.05)。
【关键词】：特发性中枢性性早熟 雌激素受体α基因 Pvu Ⅱ Xba Ⅰ 多态性 基因型 骨形成标志物 骨钙素 骨型碱性磷酸酶 C型利钠肽氨基末端
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.8
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-23
• 第一章 特发性中枢性性早熟女童雌激素受体α基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性分析23-34
• 引言23
• 1 材料与方法23-24
• 2 实验方法24-27
• 3 结果27-30
• 4 讨论30-34
• 第二章 血清骨形成标志物在特发性中枢性性早熟女童中的测定及意义34-42
• 引言34
• 1 材料与方法34-35
• 2 实验方法35-37
• 3 结果37-38
• 4 讨论38-42
• 第三章 特发性中枢性性早熟女童雌激素受体α基因Pvu Ⅱ和XbaⅠ多态性与骨形成标志物的关系42-48
• 引言42
• 1 材料与方法42-43
• 2 结果43-45
• 3 讨论45-48
• 参考文献48-57
• 中英文缩略词对照表57-58
• 附录58-59
• 成果59-60
• 综述60-70
• 参考文献65-70
• 致谢70-71

【参考文献】

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1 柯江维;杨玉;段荣;陈强;刘志强;杨利;谢理玲;;雌激素受体α基因多态性与女孩性早熟关系的研究[J];中国实验诊断学;2010年10期

  本文关键词：特发性中枢性性早熟女童雌激素受体α基因Pvu Ⅱ和Xba Ⅰ多态性分析与血清骨形成标志物的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：395719