新生期小鼠胰岛细胞变化及其增殖机制的研究

发布时间：2017-06-23 23:05

  本文关键词：新生期小鼠胰岛细胞变化及其增殖机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1、建立新生期小鼠胰岛分离纯化方法。2、研究新生期小鼠胰岛细胞的动态变化。3、观察新生期小鼠胰岛细胞周期相关基因的表达变化,探讨其与胰岛细胞增殖的关系。方法:1、胰腺局部充盈、胶原酶Ⅴ消化,单纯显微镜下手挑胰岛,获得出生后1周、3周和8周C57BL/6小鼠的胰岛。2、以胰岛素和胰高血糖素双染胰岛细胞,流式细胞术及免疫荧光法检测不同阶段小鼠胰岛β和α细胞构成比例的变化。3、采用免疫组化染色法检测不同阶段小鼠胰岛β/α细胞量、单个细胞面积、细胞数量、细胞构成比例的变化以及Rb、p107、p130、E2F1、cdk1和cyclinB1的表达变化。4、通过PI染色流式细胞术检测不同阶段小鼠胰岛细胞周期的变化。通过Ki67和胰岛素双染免疫荧光法观察不同阶段小鼠胰岛β细胞增殖的变化。5、运用实时定量PCR检测不同阶段小鼠胰岛细胞周期相关基因mRNA的表达变化。6、利用Westernblot技术分析不同阶段小鼠胰岛细胞周期相关基因蛋白的表达变化。结果:1、在1mg/mL酶浓度下,1周和3周小鼠胰岛的最适消化时间分别为23min(38.11±2.78胰岛/胰腺)和25min(66.06±2.61胰岛/胰腺)。1周以直径50μm胰岛居多(P0.01),而3周以50~99μm者居多(P0.01)。单纯手挑组胰岛得量显著高于Histopaque-1077纯化组(P0.05)。所得胰岛存活率和纯度均90%,且存在β和α细胞构成比例的变化(P0.05)。2、与1周相比,3周和8周胰岛β/α细胞量显著增加(均P0.05);单个β/α细胞面积在3周时无明显差异,8周时均扩大1.7倍(均P0.01);而β/α细胞数量在3周增加约3.5/3.7倍(均P0.01),8周与3周无明显差异;α细胞比例在3周和8周时明显下降,而β细胞比例明显增加(均P0.01)。新生期小鼠胰岛细胞增殖显著,与8周相比,1周和3周时G0/G1期细胞明显减少(均P0.05),而G2/M期显著增多(均P0.05),细胞增殖指数明显增加(均P0.01)。1周时Ki67、胰岛素双阳性细胞占胰岛素阳性细胞比例明显高于3周和8周(P0.01)。3、与1周相比,8周时Rb、p107、E2F1/2/3、cyclinD1/E1/A1/A2/B1/B2、cdk6/2/1、cdc25b/c、Wee1mRNA表达明显降低(均P0.05),而p130、E2F4/5、cdc25amRNA表达增高。cdk4在3周时表达显著高于1周和8周(P0.05)。从出生后1周、3周至8周,p16和p27mRNA表达均逐渐降低,而p21在3周时较高。免疫组化显示:Rb、p107、p130、E2F1均在不同阶段胰岛细胞胞浆中差异表达;cdk1和cyclinB1在胞浆和胞核中均有表达,且不同阶段胰岛存在差异。Westernblot结果显示:与1周相比,8w时Rb、p107、E2F1、cdk1和cyclinB1表达均明显降低,p130表达显著增高(均P0.05)。结论:1、胰腺局部充盈、胶原酶Ⅴ消化后镜下手挑胰岛是一种较好的新生期小鼠胰岛分离纯化方法,消化时间和纯化方法是其重要影响因素。2、新生期小鼠胰岛细胞量扩增明显,以细胞数量增加为主;细胞构成比例变化显著;细胞增殖显著,其中β细胞增殖明显。3、新生期小鼠胰岛细胞中细胞周期相关基因在mRNA水平和蛋白水平均存在显著表达变化,提示其可能参与新生期胰岛细胞增殖的调控。
【关键词】：新生期 胰岛细胞 增殖 细胞周期相关基因
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 研究背景12-14
• 参考文献13-14
• 第一部分 新生期小鼠胰岛分离纯化方法的研究14-27
• 摘要14-15
• Abstract15-16
• 引言16
• 1、实验材料16-19
• 2、实验方法19-20
• 3、实验结果20-23
• 讨论23-25
• 参考文献25-27
• 第二部分 新生期小鼠胰岛细胞变化的研究27-41
• 摘要27-28
• Abstract28-29
• 引言29
• 1、实验材料29-32
• 2、实验方法32-34
• 3、实验结果34-38
• 讨论38-40
• 参考文献40-41
• 第三部分 新生期小鼠胰岛细胞周期相关基因的表达变化41-65
• 摘要41-42
• Abstract42-43
• 引言43
• 1、实验材料43-49
• 2、实验方法49-53
• 3、实验结果53-58
• 讨论58-62
• 参考文献62-65
• 结论与展望65-66
• 文献综述66-75
• 参考文献72-75
• 攻读学位期间发表文章情况75-76
• 致谢76

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本文编号：476503