小儿肝母细胞瘤血清中非炎症标记物的筛选及鉴定

发布时间：2017-06-25 09:01

  本文关键词：小儿肝母细胞瘤血清中非炎症标记物的筛选及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 肝母细胞瘤在小儿中的发病率约为0.5～1.5/百万，在所有小儿肝脏恶性肿瘤中约占50%～79%，是小儿最常见的肝脏恶性肿瘤，发病年龄多为出生后6月~3岁，男孩多见。其病因目前仍不明确，可能与胚胎时期肝脏细胞结缔组织分化发育异常、氧自由基损伤肝细胞及遗传因素等因素有关。肝母细胞瘤早期多无特殊临床症状，首发症状多是表现为上腹部巨大包块。肝母细胞瘤多为单发性，肝右叶常见。肝母细胞瘤的病理分型包括胎儿型、胚胎型及混合型。肝母细胞瘤的影像学检查包括B超、CT（包括ECT）及肝动脉造影等。约有1/2～2/3患儿被认为是不能Ⅰ期切除，且发现时多有肺脏等远处转移，故未能完整切除瘤体的患儿往往预后不良。但是，肝母细胞瘤仍然是可治愈的小儿恶性肿瘤，早期诊断及早期治疗可以显著提高患儿生存率。 近二十年来，蛋白质组学飞速发展，根据其研究的目的和方法的差异，蛋白质组学分为结构蛋白质组学、功能蛋白质组学和表达蛋白质组学。蛋白质组学中最有价值的优点在于在实验中可以观察到完整的蛋白质在生理及病理状态下的变化。其主要相关技术包括双向凝胶电泳、差异凝胶电泳、质谱分析等，近年来蛋白质芯片技术、酵母双杂交系统和生物信息学分析也应用于蛋白质组学，通过上述技术可对蛋白质的种类、结构和功能进行分析确定。蛋白质组学在肿瘤中的应用主要有①发现新的标志物；②鉴定肿瘤相关蛋白质作为早期临床诊断的工具；③探索疾病的发病机制和治疗途径。生物磁珠可将血清中所含的复杂样品中的蛋白质富集并纯化，这利用的是离子磁珠的特殊吸附功能。不同类型、不同功能的磁珠可吸附不同的肽段或蛋白质,磁珠捕获后的蛋白也亦洗脱下来进行浓缩，从而增加了目标蛋白的数量，提高在凝胶电泳中的敏感度，使蛋白组学技术更趋稳定。目前，磁珠已广泛应用于蛋白质组学中，从而对于差异性峰值的鉴定大有裨益。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术和蛋白质芯片技术，为进一步研究蛋白质提供了新的途径。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MELDI-TOF-MS）的推广可对样本中的蛋白质进行全景检测和分析，从而显示各种差异性蛋白的分子量及相对丰度，从而监测疾病早期蛋白质的变化。由此可见，蛋白质组学从微观水平研究蛋白的属性，使人们对细胞变化、疾病的演变有一宏观的认识。对于肿瘤，其发病过程中某些蛋白质的表达或变化，也清晰的呈现在我们面前。在肿瘤的发生发展过程中，炎症因子与其密切相关，国际上权威的《Cancer》、《Cell》等杂志也都提到了炎症与癌症密切关联。其原因可能是miRNA的存在，而每个miRNA可以调控若干蛋白。因此，实验中，排除相关炎症因子的干扰显得犹为重要。本研究主要应用双向电泳（2-DE）和质谱技术（MS）对肝母细胞瘤患儿术前血清、炎症患儿（SIRS）血清及正常小儿血清进行检测，筛选出相对特异的非炎症蛋白质标记物，并进行鉴定，构建更为完善的肝母细胞瘤早期诊断血清蛋白质指纹图谱模型，为进一步研究小儿肝母细胞瘤的血清中特异性蛋白奠定基础。通过对肿瘤样本进行蛋白质检测，并绘制蛋白质指纹图谱，与相应对照组蛋白指纹图谱比较，可找到多种差异蛋白质，并优化成为标志物组合模型，多种肿瘤标志物的组合可提高诊断的特异性和敏感度。蛋白质指纹图谱技术为筛选具有特异性和敏感性的标志物提供了新的研究思路和方法。 目的 通过蛋白质组学技术，在排除炎症因素干扰下，检测小儿肝母细胞瘤血清中相对特异的蛋白质，构建更加完善和齐备的肝母细胞瘤早期诊断的蛋白质图谱框架，为进一步研究小儿肝母细胞瘤的血清中特异性的蛋白奠定基础。材料与方法 材料 收集我院自2011年12月至2013年10月小儿肝母细胞瘤患儿术前血清30例，其中男19例，女11例，年龄2月～5岁，平均1.9+0.2岁，且术后病理证实为肝母细胞瘤；全身炎症反应综合症（SIRS）患儿20例，男12例，女8例，年龄6月～10岁，平均3.5+0.1岁。收集正常儿童血清20例，其中男10例，女10例，年龄6月～9岁，平均3.8+0.2岁。均在清晨05:00～06:00空腹状态使用干燥管抽取血标本，于室温下静置1h后，使用3000r/min离心机离心20min，，取上清液，标记后迅速于-80℃冰箱保存。 方法 1.血清通过弱阳离子磁珠（MB-WCX)处理 将肝母细胞瘤患儿血清、SIRS患儿血清和对照组血清于冰水浴中解冻，4℃离心10000r/min离心5min，取5ul上清，应用弱阳离子（MB-WCX）磁珠芯片对其进行上样。 2.采用SELDI-TOF-MS质谱系统进行血清差异蛋白筛选 设置质谱仪的参数、最佳激光强度和最佳灵敏度，将结合好的蛋白质芯片装入质谱仪中进行检测，并详细记录。在SELDI-TOF-MAS平台上，对血清差异蛋白进行筛选。通过软件进行分析，得到样本中各个蛋白的m/z峰值，选择其中差异小于0.3%的考虑为一类。对所得数据进行Wilcoxon秩和检验，分析肿瘤组与正常组、正常组与炎症组之间的数值，从中得到两组差异性m/z峰值，选择范围+0.3%，进而发现肿瘤血清中特异性的蛋白峰值，并与炎症血清中锋值对比，排除是否与炎症因子相关。 3.采用电泳方法对蛋白进行分离 制备胶体后，取离心后血清5ml，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，参考Protein Ladder，切取对应轴上的胶片，并进行标记。 4.胶内酶解 参考胶内酶解说明书，对切取的胶片进行酶解，加入提取液后，离心提取上清液。 5.采用MALDI-TOF-MS确定目标蛋白 采用Nano HPLC于蛋白芯片上打板后，用MALDI-TOF/TOF进行鉴定。收集相应的肽段后，在SwissProt数据库中查找相应的目标蛋白。 结果 1.小儿肝母细胞瘤术前组与正常组的比较结果 小儿肝母细胞瘤术前组和正常组质谱数据经过标准化处理，通过分析得到各自的峰值，采用Wilcoxon秩和检验对两组峰值进行分析，从而得到10个特异性m/z峰值（P0.01）。分析得出：小儿肝母细胞瘤高表达的有4个，小儿肝母细胞瘤低表达的有6个。经过SVM筛选出youden指数最高的组合模型，得到m/z峰位于9348蛋白标记物一个。该标记物在小儿肝母细胞瘤血清术前组中低表达，表达强度分别为29.0+20.9（m/z9348）。在正常儿童组高表达，表达强度为2036.7+881.5（m/z9348）。两组比较差值具有统计学意义（P0.01）。 2. SIRS患儿组与正常组的比较结果 SIRS患儿组与对照组的质谱数据经过处理和统计学分析后，得到特异性m/z峰10个（P0.01）。分析得出：其中SIRS组中高表达为6个，SIRS组中低表达的有4个。参考youden指数最高的组合模型，得到m/z峰位于5833的蛋白质标记物一个。在炎症患儿中高表达，表达强度为1283.0+943.3（m/z5833）。在正常儿童组中低表达，表达强度为75.7+75.1（m/z5833）。两组比较差值具有统计学意义（P0.01）。 3.小儿肝母细胞瘤血清中与炎症相关的特异性峰值结果 利用SELDI-TOF-MAS平台分别在小儿肝母细胞瘤组与正常组、炎症组与正常组得到特异性峰值，通过两组结果的比较，两组间有差异性蛋白质峰值，其中m/z峰位于9348蛋白标记物在炎症组中未找到相似值（参考范围为+0.3%）。结果表明m/z峰位于9348蛋白标记物为非炎症标记物。 4.特异性蛋白的鉴定 分离、纯化、酶解血清标本中的目标蛋白，利用MALDI-TOF-TOF平台对得到的肽段进行检测。经检索得到，m/z峰位于9348的蛋白质经过鉴定为ApoAI，m/z峰位于5833的蛋白质经过鉴定为CCL7。 结论 1、m/z峰为9348的蛋白质经过鉴定为ApoAI，考虑为肝母细胞瘤中非炎性标记物，可为肝母细胞瘤构建更为完善的蛋白质组学图谱。 2、前期实验表明载脂蛋白存在于其它肿瘤中，此次实验表明肝母细胞瘤中ApoAI低表达，对进一步研究ApoAI具有参考意义。
【关键词】：小儿肝母细胞瘤 蛋白质组学 标记物 载脂蛋白AI
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文缩略词16-17
• 前言17-20
• 材料与方法20-24
• 结果24-28
• 讨论28-35
• 结论35-36
• 附图36-37
• 参考文献37-40
• 综述40-52
• 参考文献49-52
• 个人简历及在学期间发表的学术论文52-53
• 致谢53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;ApoB/apoA1 is an effective predictor of coronary heart disease risk in overweight and obesity[J];Journal of Biomedical Research;2011年04期

  本文关键词：小儿肝母细胞瘤血清中非炎症标记物的筛选及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：481471