miR-26a对胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞合成肺表面活性物质的影响及其机制研究

发布时间：2017-06-25 16:12

  本文关键词：miR-26a对胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞合成肺表面活性物质的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome,RDS)是新生儿期常见危重症之一,有较高的发病率和病死率,也是导致婴幼儿期慢性肺疾病的主要原因。尽管采用了类固醇产前预防性治疗和外源性肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)替代治疗,RDS的发生率及病死率虽有较为显著下降,但目前其发病率及死亡率仍较高,一些重度RDS患儿临床疗效仍不尽如人意。因此,多年来RDS的防治一直是新生儿学科研究热点。近年来,临床医学、流行病学及生物化学都充分证明RDS是由基因突变、严重感染、缺氧等多种内外因素相互作用、共同参与的。这些因素可直接损伤II型肺泡上皮细胞,也可通过炎症反应引起肺泡毛细血管内皮细胞损伤而导致血管壁通透性增加,血浆及纤维蛋白原渗出引起肺泡透明膜形成,致使原发性或继发性PS分泌不足。迄今为止,许多因素的作用机制尚不十分清楚,进一步探讨RDS的发病机理是防治该疾病的根本途径。最新研究显示,micro RNAs(mi RNAs)可能参与调节了几乎全部的细胞机制,在许多疾病中mi RNAs均有表达变化并参与了这些疾病的发病机制。目前,针对mi RNAs的研究主要集中于癌症领域,而在RDS领域的研究中尚未见有关mi RNAs的报道。我们课题组前期进行了胎鼠肺组织肺发育晚期不同时间点mi RNAs微阵列分析,发现mi R-26a有差异性表达且随时间推移表达逐渐上调。另外,我们通过对早产儿RDS组和正常患儿组血中mi RNAs微阵列分析也显示两组mi R-26a表达有显著性差异,RDS组血中mi R-26a表达显著上调。研究发现,mi R-26a基因在人类,大鼠,猕猴等哺乳动物体内高度保守,位于同一条染色体(Chr3)的有意义链,且已有研究证实它在肿瘤发生、器官发育、细胞增殖等生物过程中起着重要作用。因此,我们推测mi R-26a可能在肺发育及RDS发生发展过程中亦发挥着一定的作用。本课题分为两部分,第一部分对mi R-26a进行生物信息学分析,从而初步明确其靶基因及作用通路。第二部分探讨mi R-26a对胎鼠II型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells,AECII)合成肺表面活性物质的影响及其机制研究。第一部分mi R-26a的生物信息学分析目的:对mi R-26a进行靶基因预测及相关生物信息学分析,为mi R-26a靶基因的实验验证提供数据支持,并为深入研究mi R-26a在肺发育中的生物学功能及调控机制奠定基础和提供理论依据。方法:应用Pubmed、Google等工具采用“mi R-26a”关键词搜索有关mi R-26a的研究;应用mi RBase获取mi R-26a的序列,并分析其序列保守性;利用mi RNA靶标基因数据库mi RGen2.0进行mi R-26a的靶基因预测,选取Pic Tar、Target Scan S、DIANA LAB-Tar Base6.0数据库对靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)及信号转导通路分析(Pathway-analysis)。结果:已有的研究提示mi R-26a在肿瘤、细胞分化、器官发育、免疫系统等生物学过程具有重要作用。mi R-26a在多物种间高度保守。mi R-26a调控的靶基因存在于包括细胞膜、胞质、胞核等各个细胞组分中,其生物学功能主要包括转录调控、蛋白质修饰、细胞的增殖、凋亡、分化、调节蛋白激酶活性等;信号转导通路显著富集于Wnt信号通路,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-beta)信号通路、p53信号通路等。结论:mi R-26a可能通过作用于BMP信号通路,Wnt信号通路,TGF-beta信号通路等在肺发育及新生儿呼吸窘迫综合症中发挥重要作用。第二部分mi R-26a对胎鼠II型肺泡上皮细胞合成肺表面活性物质的影响及其机制研究目的:探讨mi R-26a在胎鼠II型肺泡上皮细胞合成肺表面活性物质中的作用以及机制。方法:采用体外合成mi R-26a前体对应的基因组片段,定向插入GV264载体,在大肠杆菌中高效同源重组,获得完整的重组穿梭质粒,将其与携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染HEK293细胞并扩增出mi R-26a过表达腺病毒载体Ad-26a;采用胰酶联合胶原酶消化肺组织,差速离心及反复贴壁法纯化胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells II,AECII),进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,台盼蓝染色法判断细胞活力,免疫荧光化学SP-C法检测细胞的纯度,透射电镜对细胞进行鉴定;随后应用Ad-26a感染原代培养的AECII,通过荧光显微镜下观察AECII绿色荧光蛋白的表达,利用定量RT-PCR技术检测AECII中mi R-26a的表达情况,采用MTT检测AECII的增殖情况,运用定量RT-PCR和Western blot检测SMAD1以及肺表面活性物质相关蛋白如SP-B,SP-C的表达情况。结果:1.mi R-26a腺病毒过表达载体感染AECⅡ48h后,93%的细胞均表达增强型绿色荧光蛋白。2.经定量RT-PCR法检测成熟mi R-26a的表达水平,结果显示过表达mi R-26a组mi R-26a的表达水平较空载阴性对照组以及空白对照组显著升高(P0.05),表明mi R-26a过表达载体构建成功。3.RT-PCR结果显示过表达mi R-26a组中SP-B、SP-C的核酸表达水平显著下降,且Western Blot结果同时显示SP-C的蛋白表达水平亦有显著下降(P0.05),提示过表达mi R-26a抑制了AECII肺表面活性物质的合成。MTT检测显示过表达mi R-26a对AECII细胞增殖无显著影响(P0.05)。4.进一步研究显示过表达mi R-26a组中SMAD1的核酸表达水平及蛋白表达水平均显著下降(P0.05)。结论:mi R-26a通过调节靶基因SMAD1的表达,从而影响AECII中肺表面活性物质的合成。提示mi R-26a可能参与调控肺泡II型细胞的发育以及肺泡表面活性物质的生成,为进一步研究RDS的发病机制提供一些依据。
【关键词】：miR-26a 靶基因 生物信息学 肺发育 miR-26a 肺表面活性物质 II型肺泡上皮细胞 胎鼠
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.1
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-17
• 第一部分 miR-26a 靶基因的预测及生物信息学分析17-24
• 材料与方法17-18
• 结果18-22
• 讨论22-24
• 第二部分 miR-26a对胎鼠II型肺泡上皮细胞合成肺表面活性物质的影响及其机制研究24-48
• 材料和方法24-39
• 结果39-44
• 讨论44-48
• 全文小结48-49
• 参考文献49-55
• 综述55-67
• 参考文献62-67
• 附录一 英文缩略词67-68
• 附录二：硕士在读期间科研工作小结68-69
• 已发表文章69-73
• 致谢73

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  本文关键词：miR-26a对胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞合成肺表面活性物质的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：482741