表没食子儿茶素没食子酸酯对乳腺癌细胞MT1-MMP表达及上皮间质转化的影响研究

发布时间：2017-07-01 03:15

  本文关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯对乳腺癌细胞MT1-MMP表达及上皮间质转化的影响研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的： 世界范围内,乳腺癌以其逐年升高的发病率成为女性恶性肿瘤的首位。在我国,乳腺癌的发病率也逐年增长,并且越来越年轻化。尽管手术为主的综合治疗取得了一定的进步,但转移和复发仍是部分乳腺癌患者预后不佳的主要因素。癌症转移扩散仍然是癌症治疗的最大障碍。明确转移的分子机制是至关重要的,从而能有效的研发并使用新颖的抗转移治疗策略应用于临床。 肿瘤细胞迁移被认为是转移级联中至关重要的一步。目前研究表明,降解肿瘤细胞周围的基质是乳腺癌发生浸润转移的首要条件。参与基质降解的酶类主要是基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases; MMPs)能通过多种方式促进肿瘤的浸润和转移。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一族Zn2+依赖性内肽酶,可以降解绝大多数基质成分。在肿瘤产生的基质金属蛋白酶中,MMP-2起着非常重要的作用,它具有Ⅳ胶原酶的活性,可以降解基底膜使肿瘤细胞发生浸润。MMP-2是以原酶形式产生,目前认为其激活必须依赖MMPs重要成员膜型基质金属蛋白酶-1(membrane-type1matrix metalloproteinase; MT1-MMP)。在肿瘤中MMPs的表达反映内在组织异质性,正如不同的肿瘤表达不同的ECM组件、细胞表面受体和相关的细胞组织。然而,许多基质金属蛋白酶,包括金属蛋白酶-1、2、3、7-11和MT1-MMP(MMP-14)在许多人类肿瘤过表达。 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)与肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)的关系密切。MMP能够破坏由基底膜(basement membrane, BM)和细胞间基质(jinterstitial matrix)组成的ECM(extracellular matrix)。各种损伤因素导致上皮组织基底膜构造的改变,是导致EMT过程的必要条件。MMP具有降解胶原蛋白、层黏连蛋白和纤维黏连蛋白的能力,使得基底膜被降解,进而诱导EMT的产生,从而导致肿瘤细胞的增殖和迁移能力的改变。在EMT过程中,E-钙黏蛋白(Ecadherin)具有非常重要的作用。当细胞间有E-钙黏蛋白连接时可以有效地调节细胞的生长,当转化为N-钙黏蛋白时,细胞生长失去控制,从而产生具有纤维细胞或者内皮细胞作用的能力。另外,N-钙黏蛋白可以促进细胞增殖与存活,E-钙黏蛋白在乳腺癌中呈表达下调而N-钙黏蛋白表达上调。MMPs是间质细胞表型的特有蛋白之一,既可以作为EMT发生的一个重要标志物,又可以诱发EMT。鉴于MMPs是诱导EMT过程的一个关键因素,MMIPs抑制剂则被认为可以有效阻断肿瘤细胞发生EMT过程。研究MMPs抑制剂应用于临床上应对MMPs促进EMT及其引发的癌症进展是一个巨大的挑战：(1)在肿瘤进展过程中的特定时期,识别特定的MMP的靶点作为促进EMT恶性肿瘤的主要驱动因素；(2)发展分子治疗方法应用于研究抑制MMP靶向抗肿瘤药物。因此,靶向MMPs已成为临床防治肿瘤的一个新策略,MMPs抑制剂首当其冲地成为一个研究热点。目前,多达50多种MMPs抑制剂被列入临床治疗肿瘤的候选药物,但其中大部分的疗效并未得到肯定。缺乏特异性则是其主要原因,故靶向MMP-EMT途径的肿瘤治疗仍然面临着很大的挑战,不仅需要鉴定出涉及肿瘤进展、促进EMT的主要或单一MMP,而且需要开发出具有高度特异性、选择性的MMPs抑制剂。 绿茶是世界上大多数消费饮料之,是从茶树的叶子中提取的,是一种常绿灌木山茶科家族。其主要成分为茶多酚,其特点是大量儿茶素的存在,包括epigallocatechin-3-gallate (EGCG)、儿茶素(EGC)epicatechin-3-gallate和表儿茶素(EC)。其中,EGCG一直被认为是最强大的防护剂应用于癌症化学预防。近年来,越来越多的研究证实茶多酚化合物具有抗肿瘤作用。茶多酚中主要有效成分为表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG),占茶多酚的80%左右。近几年对EGCG抗癌机制的研究越来越重视：1.诱导肿瘤细胞凋亡；2.诱导肿瘤细胞周期阻滞；3.对细胞信号传导通路的影响；4.抑制肿瘤细胞转移和侵袭；5.抑制肿瘤增殖和血管生成。研究发现,不论在体外还是体内,EGCG对许多肿瘤细胞的浸润与转移具有抑制作用。在人纤维肉瘤HT-1080细胞中,EGCG能抑制膜类基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)活性从而导致MMP-2在细胞表面积聚。这可能是EGCG抑制肿瘤细胞侵袭的作用机制。目前已有研究提示,EGCG可抑制MMP-2活性从而抑制肿瘤细胞浸润与转移。关于EGCG与基质金属蛋白酶家族的关系鲜有报道,主要集中在EGCG抑制MMP-2活性研究上,而EGCG抑制MMP-2的活性可能主要是因为EGCG抑制MT1-MMP蛋白活性。然而,目前国内外针对EGCG抑制MT1-MMP活性的研究的报道较少。因此,本研究拟探讨EGCG是否能够通过抑制MT1-MMP对乳腺癌起抑制作用。 为此,本研究首先验证涉及肿瘤进展、促进EMT的主要或单一MMPs为MT1-MMP,然后以不同浓度EGCG药物干预过表达MT1-MMP蛋白的乳腺癌细胞后,检测其上皮间质转化、增殖能力及细胞侵袭力的情况,从而探讨EGCG抑制乳腺癌MT1-MMP蛋白表达、抑制EMT过程、浸润和转移的内在机制。 研究方法： 1.检测MT1-MMP在不同人乳腺癌细胞系中的表达情况。选取6种乳腺癌细胞株(MDA-MB-435s、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7、BT549、HS578T),我们采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测各乳腺癌细胞系中MT1-MMP的mRNA表达水平。以GAPDH作为内参基因较正mRNA含量的变异,每份样品均进行3次重复独立实验。采用扩增倍数(2-△△Ct)表示MT1-MMP的mRNA相对表达量,扩增倍数=2-△△Ct。 2.利用pcDNA3.1-MT1-MMP真核表达载体,检测过表达MT1-MMP对乳腺癌细胞系的影响。我们成功筛选出低表达MT1-MMP的乳腺癌细胞系MCF-7后,将MCF-7乳腺癌细胞分成(1)未转染组；(2)空白质粒组；(3)转染组,利用脂质体Lipofectamine2000将pcDNA3.1-MT1-MMP转染至乳腺癌细胞株MCF-7。在乳腺癌细胞系MCF-7中过表达MT1-MMP,通过实时荧光定量PCR检测各组MT1-MMP的mRNA表达水平,蛋白印迹(Western blotting)技术检测各组MCF-7细胞内MT1-MMP蛋白的表达情况,Western blot检测EMT相关标志物蛋白的表达水平,CCK-8实验检测了细胞增殖能力是否发生变化,Transwell实验观察了过表达MT1-MMP后细胞侵袭能力是否发生变化； 3.检测不同浓度的EGCG处理后对各组乳腺癌细胞系的影响。对各组分别予0、5、10、15umol/LEGCG处理后,通过实时荧光定量PCR检测MT1-MMP的mRNA表达水平是否发生改变,Western blot检测了EMT相关分子的蛋白表达水平是否变化,CCK-8实验观察了细胞增殖能力是否发生变化,Transwell实验观察了过表达MT1-MMP后细胞侵袭能力是否发生变化； 4.实验数据均用SPSS13.0统计软件处理。细胞增殖试验、细胞侵袭实验均用mean±SD表示。如果方差齐,采用方差分析(One-Way ANOVA)多组间比较,然后采用LSD法进行两两比较,如果方差不齐,采用Welch法多组间比较,然后采用Dunnet's T3方法进行两两比较。检验水准α=0.05,p0.05有统计学意义。 结果： 1) MT1-MMP在不同乳腺癌细胞系中的表达不同,其中在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达最高,而在乳腺癌细胞系MCF-7中表达最低。本文以乳腺癌细胞系MCF-7为细胞模型进行研究； 2)命名为pcDNA3.1-MT1-MMP真核表达载体,首先在乳腺癌细胞系MCF-7中过表达MT1-MMP,将MCF-7乳腺癌细胞分成：(1)未转染组(MCF-7)；(2)空白质粒组(pcDNA3.1-MCF-7);(3)转染组(pcDNA3.1-MT1-MMP-MCF-7)。实时荧光定量PCR检测各组MT1-MMP的mRNA的表达情况,发现转染pcDNA3.1-MT1-MMP后,MCF-7的MT1-MMP的mRNA的表达水平上调；Western blot检测发现,转染pcDNA3.1-MT1-MMP后,出现MT1-MMP蛋白表达；过表达MT1-MMP后EMT相关分子E-cadherin蛋白表达水平下调,而N-cadherin蛋白表达水平则上调；与此同时,CCK-8实验观察发现细胞增殖能力增强,Transwell实验观察发现细胞侵袭能力增强。这证明过表达MT1-MMP能促进EMT发生、细胞的增值及侵袭能力增强； 3)对各组分别予0、5、10、15umol/L EGCG药物处理后,通过实时荧光定量PCR检测发现,EGCG处理后,MT1-MMP的mRNA表达水平显著下调,Western blot检测发现EGCG处理后MT1-MMP的蛋白表达水平下调,且EMT相关分子E-cadherin蛋白表达水平上调,而N-cadherin蛋白表达水平则下调；EGCG处理后,CCK-8实验检测发现各组细胞增殖减缓,Transwell实验观察发现各组细胞侵袭能力减弱,且15umol/L EGCG处理组细胞侵袭及增殖能力最小。这说明EGCG处理后能有效抑制EMT发生、细胞的增殖及侵袭能力减弱。且具有浓度依赖性。 结论： 1) MT1-MMP在不同乳腺癌细胞系中表达不同,其中在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达最高,而在乳腺癌细胞系MCF-7中表达最低。 2) MT1-MMP对乳腺癌细胞系MCF-7的影响。过表达MT1-MMP能促进乳腺癌细胞系EMT的发生及增殖能力和侵袭能力增强； 3) EGCG对乳腺癌细胞EMT的发生、增殖能力、侵袭力具有抑制作用,其机制可能与抑制MT1-MMP有关。
【关键词】：表没食子儿茶素没食子酸酯 基质金属蛋白酶 膜型基质金属蛋白酶 -1 上皮间质转化 乳腺癌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-29
• 1.1 MT1-MMP的结构、表达的调节机制、激活和抑制作用18-21
• 1.2 EMT与MMPs的关系和临床意义21-24
• 1.3 EGCG的抗肿瘤作用24-27
• 1.4 本研究的主要研究内容27-29
• 第二章 实验材料与方法29-43
• 2.1 实验材料29-31
• 2.2 实验方法31-43
• 第三章 结果43-53
• 3.1 实时荧光定量RT-PCR检测人乳腺癌细胞系中MT1-MMP的表达43-44
• 3.2 转染pcDNA3.1-MT1-MMP后,过表达MT1-MMP对乳腺癌细胞系MCF-7影响44-47
• 3.3 检测不同浓度的EGCG处理后对各组乳腺癌MCF-7细胞系的影响47-53
• 第四章 讨论53-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-73
• 硕士论文发表情况73-74
• 附录74-76
• 致谢76-78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 孙正魁;马行天;唐华;姚榛祥;;乳腺癌干细胞上皮-间质转化标志物表达变化及意义[J];实用癌症杂志;2010年02期

2 姚广裕;曾木圣;林鹏;宋立兵;张星;何洁华;杨名添;戎铁华;;膜型基质金属蛋白酶-1对乳腺癌细胞浸润能力的影响[J];中华肿瘤杂志;2006年09期

  本文关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯对乳腺癌细胞MT1-MMP表达及上皮间质转化的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：504443