补体—中性粒细胞反馈的炎症应答在过敏性紫癜中的作用机制研究

发布时间：2017-07-03 11:23

  本文关键词：补体—中性粒细胞反馈的炎症应答在过敏性紫癜中的作用机制研究

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【摘要】：研究背景过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura, HSP)又称许兰-亨诺紫癜,是一种常见的异质性、炎症性和自身免疫性皮肤血管炎症,其主要病理改变为真皮浅层的白细胞破碎、血管内皮细胞肿胀、中性粒细胞浸润等。临床结果显示,过敏性紫癜多发于三至十岁的儿童。过敏性紫癜发病较急,通常是先看到皮肤紫癜,大多开始出现踝关节周围,双侧小腿,病情加重时,患儿手臂,胸部和双下肢有瘀点、瘀斑。紫癜的特征是大小不等,呈紫红色,压之不退色。紫癜的特征是高出皮肤,大小不等,呈紫红色,压之不退色。通常为1-2周消退,但经常发作或持续数周,数月消退。其次为关节疼痛,约1／3至2/3患儿出现关节红肿疼痛。多见于踝关节,膝关节,甚至有些患儿出现关节积液。特点是关节肿胀,消退后不留后遗症。也有少数患儿脐痛,呕吐,或便血,肠套叠。而30%左右的儿童会出现肾损害,如血尿,蛋白尿或泌尿管炎,更为严重的表现称为肾型,一般发生在2至4周后。肾型过敏性紫癜参差不齐,大多数较轻,少数可出现肾功能衰竭。临床诊断表明,过敏性紫癜患者的中性粒细胞数量有着明显上升。中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。中性粒细胞来源于骨髓,形成特征是具有分叶形或杆状的核,胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒。这些颗粒多是溶酶体,内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类,与细胞的吞噬和消化功能有关。中性粒细胞表面表达IgGFc受体,多是中亲和力的FcyRⅡ和低亲和力的FcyRⅢ,有时受细胞因子的诱导也可表达高亲和力的FcRⅠ;还表达补体片段C3b和C4b以及某些特殊因子的受体。表面受体与相应配体作用后,可以活化中性粒细胞某方面的特殊功能。中性粒细胞在血液的非特异性免疫系统中起重要作用,它对微生物病原体,特别是在化脓性细菌入侵的第一线,当出现炎症,并将它们吸引到炎症趋化部位。中性粒细胞是通过糖酵解供能,它能够在缺氧肿胀,血流不畅的条件下生存,其细胞膜的存在,破坏这里形成附近组织的细菌细胞毒性。因为中性粒细胞中含有大量的溶酶体酶,所以能够吞噬细菌和组织碎片进入细胞内从而将其分解并消除,防止病原微生物在体内的扩散。中性粒细胞的崩解,使得溶酶体酶的释放,以溶解所有的周围组织,并形成脓肿。当人体受到急性损伤或出现化脓性细菌感染时,将有大量的中性粒细胞的聚焦到化脓位点,骨髓的造血能力增强,机体表现为外周血中性粒细胞显著增加,局部死亡的白细胞和受累细胞液化形成脓汁。中性粒细胞以其庞大的数量和迅速的行动发挥抗感染和创伤修复的作用,当中性粒细胞缺陷时,机体容易发生化脓菌感染和创伤修复缓慢。诸多研究结果表明,中性粒细胞的炎症应答在过敏性紫癜中发挥十分重要的作用,但补体-中性粒细胞反馈的炎症应答调控在过敏性紫癜中的作用机制究竟是怎样的还不是特别清楚,于是本课题就探讨补体-中性粒细胞反馈的炎症应答在过敏性紫癜中的作用机制问题展开研究。研究目的(1)以干姜、荜茇、胡椒水煎剂灌胃的方法构建过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura, HSP)动物模型；(2)通过比较模型组和正常组动物外部皮肤特征,观察造模是否成功；(3)通过比较模型组和正常组动物体温、饮食量、饮水量的变化,观察模型组和正常组动物在致敏前后一般情况的变化；(4)通过比较模型组和正常组动物致敏前后血液、尿液常规变化,观察模型组和正常组动物在致敏前后常规指标的改变；(5)比较模型组和正常组动物ROS水平、炎性因子水平、补体水平的变化,观察模型组和实验组动物在致敏前后所激发的炎症反应的改变；(6)采用免疫组织化学染色方法比较模型组和对照组病理学方面的改变观察两组动物在致敏前后病变情况。根据以上指标的观测来探讨补体-中性粒细胞反馈的炎症应答调控在HSP中的作用机制。研究方法取24只健康清洁级新西兰兔(购自于广州军区广州总医院动物实验中心,兔龄4月,雌雄各12只,体重2.2-3.0kg。将白兔按照体重随机编号分为两组,正常组和模型组各12只,雌雄各半。动物饲养于广州军区广州总医院动物中心,温度18-25℃,相对湿度40%-60%,光暗照明时间各12小时,每笼1只,自由进食和饮水。实验动物操作经动物使用管理委员会批准。将干姜、荜茇、胡椒水煎剂(购于广州中医药大学第一附属医院)用1：1：1的比例配置成终浓度为15g/100 ml的液体溶液,在实验开始前两周,正常组兔子给予200g/只/天普通饲料；模型组兔子则予以饲料的基础之上灌胃1 ml上述药液,每日1次,正常组用等量生理盐水灌胃,其他条件尽可能保持一致。另外,模型组动物还采取腹腔注射的方式加用卵白蛋白-弗氏佐剂1ml/只／天,连续3周,以达到连续抗原刺激致敏的目的,正常组动物注射等量生理盐水。腹腔注射3周之后,模型组动物再通过耳缘静脉注射0.5 ml浓度为10 mg/ml的卵白蛋白生理盐水,背部皮肤剪毛皮下分5个位置点注射0.3%卵白蛋白生理盐水0.2 ml。在抗原冲击激发过敏反应之后,观察每点皮肤局部红肿的情况以验证模型是否构建成功。比较两组兔的饮食、饮水量、体温、血液常规和尿液常规变化及氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)、炎性因子和补体成分的改变,同时以N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine, NAC)和过氧化氢(H202)干预ROS水平,并观察上述指标的变化。研究结果模型组动物在激发过敏后,体温明显升高,精神状态萎靡、运动量减少,饮水量和饮食量均较致敏前显著降低(P0.05),而这一现象在正常组动物中未发现;对正常组和模型组动物皮肤组织进行HE染色,可观察到模型组相比于正常组出现明显的病理学改变,这些病理变化在ROS促进的模型组中更为严重,但在ROS抑制组中,HE染色结果显示皮肤组织的损伤程度得以明显改善；而且模型组动物相比于正常组动物的血液常规指标WBC、MCHC、NEU、NEU%水平明显升高,RBC、HGB、EOS和EOS%含量显著降低(P0.05),而MCH和PLT则无明显变化(P0.05)；模型组动物的尿液出现拉丝、气味大的情况,其中66.67%出现尿蛋白阳性、58.33%出现尿红细胞、25%白细胞阳性；另外,模型组动物的ROS水平、炎性因子水平、TGF-p、补体及TNF-a水平也均明显升高；在ROS抑制剂NAC处理之后,上述指标水平明显降低(P0.05),而在应用ROS激动剂H202处理之后,这些指标却明显加剧升高(P0.05)。研究结论本课题首次使用大耳白兔模型研究HSP的具体致病机理,通过卵白蛋白和弗氏完全佐剂持续抗原刺激以激发过敏反应来构建HSP模型,以期为研究HSP的致病机制提供切实可行的实验模型和研究载体,并深入探讨活化和抑制ROS情况下中性粒细胞介导的炎性反应的应答调控变化。本研究结果显示,在HSP模型兔中,炎性因子IL-2, IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α的水平明显升高,而且在ROS抑制情况下,这些炎性因子的水平也得以降低,而ROS激动的条件下,炎症反应更为显著,充分表明拮抗机体的ROS水平,能够减弱中性粒细胞介导的炎症反应应答。而且,在炎症反应发生强度较大的情况下,模型兔的血液常规指标,如WBC、MCHC、NEU、NEU%等水平也出现明显异常改变以适应机体内的炎性应激反应,进而表现为模型兔的精神状态不佳、食欲下降和运动量减少等症状。而且,HE染色也可明显观察到模型兔的皮肤组织明显的病理改变在ROS抑制情况下能够得到有效的改善,提示抑制ROS的水平不仅可以改善HSP兔的炎性指标,还能减轻疾病症状和病理表型。在模型兔中的补体C3、C4和C5的水平出现明显升高,提示补体系统在HSP发生过程中被活化,更为重要的是,抑制了ROS的水平能够减弱补体的活化程度,减轻炎症反应,表明补体-ROS反馈调节系统参与了HSP的形成和进展。研究还采取了NAC和H202双向调控ROS水平从正反两方面以证实了干预ROS能够抑制HSP的发生和进展。结果充分表明,在临床实践中应用ROS的抑制剂可能对改善HSP的疾病症状、控制患者炎症反应和促进预后有积极的作用。
【关键词】：过敏性紫癜 补体 中性粒细胞 炎症应答
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.5
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-18
• 实验方案18-20
• 2.1 总体方案18
• 2.2 研究内容18
• 2.3 技术路线18-20
• 实验材料与设备20-25
• 3.1 实验动物20
• 3.2 主要实验仪器20-21
• 3.3 主要抗体和试剂21-22
• 3.4 主要溶液配方22-25
• 实验动物模型25-26
• 4.1 连续抗原刺激致敏25
• 4.2 抗原冲击激发过敏反应25-26
• 实验方法26-32
• 5.1 石蜡包埋及切片制作26-27
• 5.2 冰冻包埋及切片制作27-28
• 5.3 振动包埋及切片制作28
• 5.4 石蜡切片HE染色步骤28-29
• 5.5 石蜡免疫组化29-30
• 5.6 冰冻切片免疫组化30
• 5.7 考马斯亮蓝法30-32
• 实验内容32-34
• 6.1 一般指标观察32
• 6.2 活性氧自由基、炎性因子和补体水平检测32
• 6.3 免疫组织化学法检测肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平32-33
• 6.4 细胞拍照计数33
• 6.5 统计学分析33-34
• 实验结果34-41
• 7.1 兔皮肤外部特征的变化34
• 7.2 兔体温、饮食、饮水量的变化34-35
• 7.3 兔血液、尿液常规的变化35-36
• 7.4 兔活性氧、炎性因子和补体水平变化36-38
• 7.5 HE染色38
• 7.6 TNF-α表达水平38-41
• 实验讨论41-45
• 参考文献45-48
• 全文总结48-49
• 综述49-63
• 参考文献59-63
• 附录63-66
• 英文缩略语词汇表66-67
• 科研与成果67-68
• 致谢68-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 皇甫燕;小儿过敏性紫癜的病机和治疗[J];浙江中医学院学报;1998年03期

2 于淑梅;;肺炎支原体感染致过敏性紫癜10例[J];临床合理用药杂志;2010年04期

3 阳剑文;豆小娟;;过敏性紫癜患儿急性期免疫学指标的变化及意义[J];现代生物医学进展;2009年22期

4 郑高;叶丽萍;贾微;张宏;黄春文;;接种麻疹减毒活疫苗和百白破三联疫苗致过敏性紫癜1例报告分析[J];医学动物防制;2007年10期

5 白庆峰;潘凯丽;黄莹;李琦;;过敏性紫癜患儿血清白介素6、白介素8及肿瘤坏死因子α水平和免疫球蛋白的变化[J];中国小儿血液与肿瘤杂志;2008年02期

6 马秀梅;;过敏性紫癜患儿血清IL-8、IL-12及TNF-α表达的意义[J];中国实用医药;2008年36期

  本文关键词：补体—中性粒细胞反馈的炎症应答在过敏性紫癜中的作用机制研究

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本文编号：513492