基于中医异病同证理论探讨轮状病毒与HBGA相关性的初步研究

发布时间：2017-07-06 06:10

  本文关键词：基于中医异病同证理论探讨轮状病毒与HBGA相关性的初步研究

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【摘要】：病毒性胃肠炎又称病毒性腹泻,是一组由多种病毒引起的急性肠道传染病。目前研究表明轮状病毒(Rotavirus, RV)、诺如病毒(Norovirus, NoV)是急性病毒性胃肠炎的最主要的两种病原体,占到所有病原体的60%以上。尽管各种病原体的基因组结构不尽相同,但它们所致胃肠炎的临床表现基本类似,主要表现为：起病急、恶心、呕吐、腹痛、腹泻,排水样便或稀便,也可有发热及全身不适等症状。因为RV和NoV是两种不同的病原体,现代医学通常将RV和NoV胃肠炎分属为两种不同的疾病进行论述。由于两者都具有呕吐、腹泻、发热等相同的临床症状和体征,RV和NoV胃肠炎应同属中医“泄泻”范畴,其病因病机之关键在于脾虚湿盛。证,是机体在疾病发展过程中的某一阶段的病理概括,亦机体对病因作用的整体反应状态,反应了疾病发展过程中某一阶段病理变化的本质。既然RV和NoV胃肠炎具有相同(或相似)的证,那么,RV与NoV感染是否存在着“异病同证”的物质基础呢?从组成人体的物质分子方面分析引起证的物质基础时,中医证的本质是一类具有信使分子性能的蛋白质和肽类分子。从病毒感染人体的发病机制而言,细胞表面的特异性受体是病毒感染宿主细胞的决定因素之一。基于此,本课题提出：RV和NoV胃肠炎“异病同证”的物质基础可能与相似的受体或共受体有关,即两种病毒存在相同的受体或共受体。由于NoV不能体外培养,亦无小动物模型,经过近十余年来的志愿者攻击试验、分子流行病学和分子生物学实验研究,现已基本确认肠道黏膜上的人类组织血型抗原(human histo-blood group antigens, HBGA)是NoV的病毒受体。HBGA是红细胞、呼吸道、泌尿生殖道和消化道粘膜上皮细胞表面的一类复杂的碳水化合物(以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在),也可以自由寡聚糖的形式分泌在唾液、血液、母乳和肠道等体液中。在肠道上皮细胞上表现为ABH和Lewis抗原,对应在红细胞上表现为分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。HBGA受体的发现成为NoV研究的里程碑,极大地推进了NoV与人类宿主相互作用关系、病毒进化及免疫学机制等方面的研究。目前,RV的受体研究主要集中在细胞功能性蛋白上,初步认为Toll样受体、整合素家族、神经节苷脂、热应激同源蛋白(Hsc70)等都有一定的作用。近期有研究表明,RV感染与HBGA受体存在相关性。本课题组在RV感染可能与HBGA相关的研究基础上,提出“RV和NoV胃肠炎异病同证的物质基础可能与相似的受体或共受体有关”。首先,我们运用分子流行病学方法,收集临床腹泻患者的粪便标本和配对唾液,以RV阴性和健康人群为对照,分析比较RV感染和HBGA相关性。同时,运用分子生物学实验方法表达RV的衣壳蛋白VP8*,进行体外RV-VP8*与唾液HBGA的结合方式研究。(一)轮状病毒感染与HGBA相关性的流行病学研究2013-2014年间在南方医院儿科门诊收集病毒性腹泻患者粪便及配对唾液样本,并以广州某小学的健康人群唾液作为对照。粪便样本通过trizol法行RNA提取,经逆转录后以cDNA为模板,行PCR扩增RV-VP4区域以及NoVG I型GII型片段。RV阳性样本进一步用分型引物进行分型,不能用分型引物分型者经公司测序后结合NCBI BLAST功能以确定其基因型别。配对唾液的HBGA表型鉴定用ELISA方法,检测的单抗包括A、B、H、Lewis a、Lewis b、Lewis x, Lewis y。其中,Lea-b+和/或Lex-y+为分泌型,Lea+b+和／或Le x+y+为部分分泌型,二者均归入分泌型；Lea+b-和／或Lex+y-为非分泌型。南方医院配对样本共266份,RV阳性样本75份,配对唾液样本中,检出A型22份,B型17份,O型33份,AB型3份;Lea-b+/Lex-y+63份,Lea+b+/Lex+y+12份,Lea+b-/Lex+y-0份,分泌型75份,非分泌型0份。阴性样本191份,剔除NoV阳性样本40例后总样本151份, 检出A型47份,B型44份,O型50份,AB型10份；Lewis状态结果Lea-b+/Lex-y+132份,Lea+b+/Lex+y+9份,Lea+b-/Lex+y-10份;分泌型141份,非分泌型10份。用SPSS 20.0统计软件,统计方法用χ2检验,RV阳性与阴性之间的血型差异Pearson χ2=3.047,自由度=3,P值=0.384(P0.05),即RV阴阳性之间的血型差异没有统计学意义。Lewis状态用Fisher精确检验,χ2=10.659,自由度=2,P值=0.004(P0.05),Lewis状态在RV感染与否中有显著性差异,即Lewis状态对RV感染与否有影响。分泌型在RV感染与否中,P值=0.033(P0.05),数据显示分泌型在腹泻患者中对RV感染与否有显著性差异,RV感染与HBGA分泌型有关。通过对健康人群159份唾液进行HBGA表型分析,结果表明,A型为35份,B型39份,O型79份,AB型6份；Lea+b+/Lex+y+134份,Lea+b-/Lex+y-5份,Lea+b-/Lex+y-20份：即分泌型139份(87.4%),非分泌型20份(12.6%)。RV阳性样本HBGA状态如前所述。用SPSS 20.0统计软件对RV阳性和健康对照进行两组间的x2检验,结果发现两组间的ABO血型差异Pearson卡方=1.546,P值=0.672(P0.05),没有统计学意义;两组间的Lewis状态经Fisher精确检验,P值=0.000(P0.05),存在显著性差异。分泌型状态经Fisher精确检验,P=0.001(P0.05),亦存在显著性差异。结果充分表明：RV感染虽然与患者的ABO血型状态没有明显相关,但是与患者的分泌型状态存在明显的相关性,RV只感染分泌型患者,而不感染非分泌型患者。(二)轮状病毒VP8*与唾液HBGA的结合方式研究随机选取选取3份轮状病毒P[8]和3份P[4]阳性样本,经one-step RT-PCR试剂盒扩增VP4区域后,再行高保真酶扩增VP8*,将目的基因VP8*插入Pjet-2载体后,连接产物转入top10后行质粒提取。重组质粒与pGEX-4T-1载体经BamH I、Sai Ⅰ双酶切后切胶回收纯化,线性载体pGEX-4T-1与目的片段VP8*连接后转化到感受态细胞top10,经菌落PCR或者菌落摇菌后质粒提取行BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定。对正确插入目的片段的质粒pGEX-4T-1-VP8*再次转化入感受态细胞BL21,通过挑选菌落摇菌、扩大培养、离心、重悬、超声破菌、离心以及与GST亲和柱吸附等步骤进行蛋白表达。最后成功表达P[8](GZ023株)和P[4](GZ705)株样本GST-VP8*蛋白。经对洗脱蛋白进行SDS-PAGE分析,证实成功获取所需的GST-VP8*融合蛋白。为后续研究VP8*与HBGA的结合模式奠定了实验基础。轮状病毒VP8*与唾液HBGA的结合方式采用ELISA法进行检测。选取84份配体唾液进行体外结合实验,其中分泌型A型22份、B型17份、O型33份,AB型3份,非分泌型(N)9份。根据梯度实验结果,选取RVP[8], P[4] GST-VP8*蛋白10μg/ml为最佳反应浓度。实验结果表明：P[8] GST-VP8*结合分泌型HBGA的OD均值分别为A=1.082, B=0.486, AB=0.590,O=1.151,即其与HBGA的结合能力为OAABB,而与非分泌型不结合。与其相类似,P[4]GST-VP8*结合分泌型HBGA的OD均值分别为A=0.348, B=0.157, AB=0.186,0=0.334,即其与HBGA结合能力为AOABB,同样的表现为与非分泌型不结合。就两者而言,RV P[8]较P[4]GST-VP8*蛋白结合HBGA能力强。该结果进一步阐明了RV感染与HBGA结合模式。P[8]、P[4]均能结合分泌型人群,且P[8]具有更强结合能力(分泌型人群占总人群80%以上),这很好地解释P[8]和P[4]能成为RV的主要流行株,而P[8]最为流行的原因。综合以上研究结果,我们首次在中国临床人群中证实轮状病毒感染与HBGA分泌型显著相关,并通过建立体外1RV GST-VP8*/HBGA结合模型,证实P[8]和P[4]均只结合HBGA分泌型,而与非分泌型不结合。该结果初步证明了我们提出的RV和NoV胃肠炎异病同证的物质基础可能与HBGA相关的理论假说,为今后开展中医异病同证的证本质研究提供示范作用,还为HBGA作为RV的受体研究指明了方向。
【关键词】：轮状病毒 VP8~* HBGA 证本质
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 前言14-25
• 1 病毒性胃肠炎主要病原体的研究概况14-15
• 2 轮状病毒和诺如病毒“异病同证”的共同受体基础研究设想15-17
• 3 轮状病毒和诺如病毒的受体研究现状17-21
• 4 HBGA受体的发现21-23
• 5 论文的研究目的和方法23-25
• 第二章 轮状病毒胃肠炎与HGBA相关性的流行病学研究25-40
• 1 材料25-28
• 2 实验方法28-31
• 3 结果31-37
• 4 讨论37-40
• 第三章 轮状病毒主要流行株P[8]、P[4]重组GST-VP8~*蛋白的表达40-55
• 1 材料40-41
• 2 实验方法41-48
• 3 结果48-52
• 4 讨论52-55
• 第四章 重组GST-VP8~*蛋白与唾液HBGA的结合方式研究55-61
• 1 材料55
• 2 实验方法55-56
• 3 结果56-59
• 4 讨论59-61
• 全文小结61-63
• 参考文献63-68
• 中英文缩略词表68-69
• 综述69-81
• 参考文献77-81
• 攻读学位期间成果81-82
• 致谢82-83

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