小鼠IL-17A和IL-17AshRNA表达质粒的构建及功能鉴定

发布时间：2017-07-14 07:21

  本文关键词：小鼠IL-17A和IL-17AshRNA表达质粒的构建及功能鉴定

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【摘要】：第一部分小鼠IL-17A基因表达质粒的构建及功能鉴定 目的：构建小鼠IL-17A基因真核表达载体，在293T细胞中验证其表达IL-17A的能力。 方法：根据Genbank中小鼠IL-17AmRNA序列（NM_010552.3）设计PCR引物，两端分别引入限制性内切酶酶切位点，，提取小鼠脾脏组织总RNA，逆转录后得到cDNA，以此为模板进行目的基因的扩增，将目的基因亚克隆至T载体中，重组T载体经双酶切及测序鉴定正确后，双酶切重组T载体，回收目的片段，在T4连接酶作用下定向克隆至真核质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中，构建IL-17A基因真核表达载体LVX-IL-17A-IRES-ZsGreen1，进行双酶切及测序鉴定。表达质粒转染293T细胞，用Real-time PCR法检测转染24h、48h后细胞IL-17AmRNA的表达量，用ELISA法检测转染24h、48h后细胞培养上清中IL-17A表达量。 结果：重组T载体及真核表达载体双酶切后电泳可见约500bp片段，与目的基因大小相符，测序结果与IL-17A基因进行BLAST比对分析完全吻合。与未转染组相比，转染组转染24h、48h后细胞IL-17AmRNA表达水平均明显增高（P均0.05）,细胞上清中IL-17A表达水平均明显增高(P均0.05)。 结论：本研究从小鼠脾脏组织中成功克隆了IL-17A基因，构建了高表达小鼠IL-17A的真核表达质粒，为今后研究IL-17A在肾小球疾病中的作用及分子机制提供了基础。 第二部分小鼠IL-17AshRNA表达质粒的构建及抑制IL-17A表达的有效序列筛选 目的：构建3个小鼠IL-17AshRNA表达质粒，在293T细胞中验证其抑制IL-17A表达的能力并筛选出抑制效率最佳的序列。 方法：根据GenBank中小鼠IL-17AmRNA序列（NM_010552.3），利用Invitrogen公司网站在线设计软件设计3条shRNA序列及1条阴性对照序列，两端分别引入限制性内切酶酶切位点，合成Oligo DNA，退火形成双链后，在T4DNA连接酶作用下定向克隆至真核载体pLVX-shRNA中，获得3个shRNA表达质粒和1个阴性对照质粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNAC），并进行测序鉴定。293T细胞分为空白对照组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、shRNAC组，各组分别进行各干扰质粒和表达质粒共转染，用Real-time PCR法检测转染24h、48h后细胞IL-17AmRNA的表量达，用ELISA法检测转染24h、48h后细胞培养上清中IL-17A表达量。 结果：各shRNA表达质粒及阴性对照质粒测序结果与Oligo DNA完全一致；与shRNA C组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组转染后24h、48h细胞IL-17A基因mRNA水平显著降低（P均0.05），shRNA1表达水平最低；细胞培养上清中IL-17A表达水平与mRNA表达水平一致。 结论：成功构建3个小鼠IL-17AshRNA表达质粒和1个阴性对照质粒；3个IL-17AshRNA表达质粒对IL-17A的表达均有抑制作用，以shRNA1抑制效果最佳。
【关键词】：IL-17A基因 真核表达质粒 293T细胞 IL-17A基因 RNAi shRNA 表达质粒
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R726.9;R3416
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 第一部分 小鼠 IL-17A 基因表达质粒的构建及功能鉴定15-40
• 前言15-17
• 1 材料与方法17-31
• 2 结果31-36
• 3 讨论36-37
• 4 小结37-38
• 参考文献38-40
• 第二部分 小鼠 IL-17AshRNA 表达质粒的构建及抑制 IL-17A 表达的有效序列筛选40-51
• 前言40-41
• 1 材料与方法41-45
• 2 结果45-47
• 3 讨论47-48
• 4 小结48-49
• 参考文献49-51
• 全文总结51-52
• 附图52-54
• 文献综述54-64
• 参考文献59-64
• 致谢64-65
• 攻读学位期间研究成果及发表文章目录65-66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：540183