TGF-β1诱导的BMSCs对髋关节发育不良髋臼软骨细胞分化的影响

发布时间：2017-07-16 10:00

  本文关键词：TGF-β1诱导的BMSCs对髋关节发育不良髋臼软骨细胞分化的影响

  更多相关文章： 发育性髋关节发育不良 软骨细胞 转化生长因子β1 骨形态发生蛋白2 细胞共培养 酶联免疫吸附反应

【摘要】：[背景及目的]发育性髋关节发育不良是小儿骨科最常见的下肢畸形。没有经过治疗的髋关节发育不良或者闭合复位后的残余髋臼发育不良,会在早期就发生髋臼软骨发育停滞及退行性变,晚期容易出现髋关节骨关节炎,大多数最终需要全髋关节置换术,严重影响这些病人的生活质量。近年来软骨组织工程学的研究和应用为关节退行性变、创伤、骨关节炎等引起的骨软骨缺失的修复提供了方向。大量研究表明转化生长因子p1能调节间充质干细胞聚集并诱导软骨形成,其下游作用因子Sox9被认为是软骨形成及软骨形态功能维持最主要的因子。应用TGF-β1可诱导MSCs向软骨细胞分化,细胞外基质主要成分胶原Ⅱ及糖胺聚糖等表达增加。但将其应用在早期DDH髋臼软骨损伤修复中研究尚未见报道。本课题在前期研究的基础上,拟利用TGF-β1诱导的骨髓间充质干细胞与DDH髋臼软骨细胞共培养,为DDH髋臼软骨细胞提供生长因子,探讨其对发育不良髋臼软骨细胞向正常软骨分化并表达分泌骨形态发生蛋白2的作用。为下一步将BMSCs置入支架培养,并植入髋臼发育不良的软骨组织,促进DDH软骨发育,为DDH引起的软骨损害提供应用软骨组织工程学的实验依据。[方法]1.DDH动物模型的建立及髋臼软骨细胞的获取1.1依据前期课题组DDH造模方法,对20只新生SD大鼠双髋双膝医用胶带并拢模拟襁褓体位固定7天作为DDH组。20只未作处理的新生SD大鼠作为正常对照组。1.2 8日龄时分别过量麻醉处死DDH组及正常组大鼠,无菌条件下取双侧髋关节,DDH组弃去造模未成功髋关节。分别取4只造模成功和4只正常髋关节做HE染色。余髋关节取髋臼软骨消化后获得髋臼软骨细胞。2. BMSCs的分离培养及鉴定2.1取10只4周龄SD大鼠,过量麻醉致死,去双侧股骨及胫骨,DMEM冲洗,全骨髓培养法获得BMSCs.2.2第三代BMSCs采用流式细胞仪鉴定CD3、CD90及CD29的阳性率。3.共培养体系的建立及BMP-2的测定3.1直接共培养体系建立：将DDH髋臼软骨细胞(DACs)、正常髋臼软骨细胞(NACs)分别与骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行直接共培养,各种细胞单独培养作为对照组；根据加入TGF-p1浓度的不同(0、10 ng/m1),每组再分为2个小组共10个小组,每组3个培养孔。3.2Transwell间接共培养体系建立：按直接共培养体系进行分组,在共培养分组中,将DACs或NACs加入transwell上室中,等量BMSCs加入transwell下室中。3.3共培养体系建立后,观察细胞形态改变,分别于共培养第三天或第三天、第七天收集各孔上清液,应用酶联免疫吸附反应测BMP-2含量。4.SPSS16.0统计和比较组间差异I结果]1.实验组20只SD大鼠发生DDH18只,建模成功率90%。大体可见：双侧髋关节外上方髋臼软骨浅平、肥大,软组织嵌入。HE染色可见DDH髋臼软骨存在组织裂隙,软骨细胞排列不均一。提示DDH髋臼软骨发育停滞,髋臼软骨细胞去分化改变。2.4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞第三代流式细胞仪鉴定结果：98.5%的第三代骨髓间充质干细胞CD29(+)+CD90(+)+CD34(一),提示第三代BMSCs纯度可达98.5%。3.单独培养的DDH髋臼软骨细胞呈长梭形,细胞分布不均匀,培养至第七天未见明显肥大的软骨细胞,提示DDH髋臼软骨细胞单独培养呈去分化改变。在与BMSCs进行共培养时并在TGF-β1存在条件下,DDH髋臼软骨细胞由长梭形变为圆形,且在共培养第三天出现中心肥大软骨细胞的出现,而未加入TGF-β1共培养体系中未观察到该形态学改变。4.直接共培养第3天测BMP-2水平,正常组BMP-2水平明显高于DDH组,差异具有统计学意义。加入TGF-β1后,DDH组BMP-2水平明显高于正常组,差异具有统计学意义。在Transwell共培养第七天,获得类似结果。[结论]1、DDH模型早期髋臼软骨表现为细胞形态由圆形变为梭形,细胞基质中出现大量裂隙；DDH髋臼软骨细胞呈去分化改变。2、单纯BMSCs可能促进正常髋臼软骨细胞分化,但不能促进DDH髋臼软骨细胞的分化。进而提示BMSCs需要额外的刺激因子共同作用以促进DDH髋臼软骨细胞的分化。3、与TGF-β1诱导的BMSCs共培养,DDH髋臼软骨细胞由长梭形变成圆形,出现细胞聚集及中心细胞肥大趋势,上清液BMP-2的分泌增高。提示TGF-β1诱导的BMSC能促进DDH髋臼软骨细胞的分化成熟4、直接的细胞接触可以促进单纯BMSCs或TGF-β1诱导的BMSCs对正常或DDH髋臼软骨细胞分化的影响。从而提示,TGF-β1诱导的BMSCs与DDH髋臼软骨细胞直接接触,可以更为有效的促进DDH髋臼软骨细胞分化成熟。
【关键词】：发育性髋关节发育不良 软骨细胞 转化生长因子β1 骨形态发生蛋白2 细胞共培养 酶联免疫吸附反应
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R726.8
【目录】：

• 缩略语4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-20
• 结果20-32
• 讨论32-36
• 结论36
• 实验不足及展望36-37
• 参考文献37-42
• 综述42-50
• References46-50
• 致谢50-51

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本文编号：548084