遗传性肥胖儿童营养干预后肠道内优势菌的分离鉴定及生理功能的探究

发布时间：2017-07-18 20:09

  本文关键词：遗传性肥胖儿童营养干预后肠道内优势菌的分离鉴定及生理功能的探究

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【摘要】：人和动物的肠道内栖息着数量庞大且种类丰富的微生物。肠道菌群通过代谢、营养、免疫等作用影响宿主健康。以乳杆菌和双歧杆菌为代表的益生菌对人体具有多种重要的生理功能。失衡的肠道菌群对膳食诱导的肥胖的重要作用已得到证实。而肠道菌群在人类遗传性肥胖中的作用还有待研究。小胖威利症(Prader-Willi syndrome,PWS)由父源15号染色体的缺失、突变或基因印记导致,是最常见的基因缺陷导致的肥胖。患者在儿童时期表现出暴食症并发展为重度肥胖。本研究中的PWS肥胖儿童接受了为期105天的富含碳水化合物和复合益生元的营养干预后,体重显著降低,糖、脂代谢相关的指标显著改善。其肠道内的乳杆菌和双歧杆菌显著增加并成为优势菌。本研究首先采用MRS琼脂选择性培养基从该PWS肥胖儿童营养干预后的粪便样品中进行乳杆菌和双歧杆菌的分离。使用变性梯度凝胶电泳技术、ERIC-PCR指纹图谱技术、16S rRNA基因测序技术等分子生物学方法对分离物进行分型和鉴定。94个分离物属于乳杆菌,74个分离物属于双歧杆菌。其中88株粘膜乳杆菌分为4种ERIC类型;3株卷曲乳杆菌仅一种ERIC类型;3株格氏乳杆菌仅一种ERIC类型。73株假小链双歧杆菌分为5种eric类型;1株长双歧杆菌为1种eric类型。为了进一步研究pws儿童营养干预后肠道内优势菌的生理功能,测定了分离株的短链脂肪酸产生能力、发酵液的抑菌能力和降解利用碳水化合物的能力,究发现,所有分离株都只产乙酸,不产其他挥发性脂肪酸。而分离株的发酵液对pws儿童营养干预前肠道内的大肠杆菌分离株、标准菌株escherichiacolimg1655和enterobactercloacaeb29无明显的抑菌作用。研究菌株降解利用复杂碳水化合物的能力发现,分离株bifidobacteriumpseudocatenulatumc95对低聚果糖和中长链菊粉的利用能力优于bacteroidesthetaiotaomicronatcc29148和eschrichiacolid45;对formulano.3(儿童膳食干预成份之一)的利用能力优于bacteroidesthetaiotaomicronatcc29148、anaerostipeshadrusbpb5和eschrichiacolid45。综上所述,本研究成功分离得到了一名pws儿童营养干预后肠道内的优势细菌——乳杆菌和双歧杆菌。发现肠道中同一类型的细菌具有丰富的菌株多样性。与肠道中其他常见共生菌的代表菌株相比,分离株bifidobacteriumpseudocatenulatumc95具有更强的碳水化合物利用能力。该菌株的全基因组信息在cog和kegg两大数据库中的基因注释结果显示,菌株自身具有丰富的代谢碳水化合物的相关基因。双歧杆菌分离株降解利用碳水化合物的能力,或许能够一定程度地解释该名儿童营养干预后肠道内双歧杆菌显著增加并成为优势菌的这一现象。双歧杆菌bifidobacteriumpseudocatenulatumc95是以志愿者健康效应为指导分离得到的关键菌,具有成为益生菌的极大潜力。
【关键词】：遗传性肥胖 肠道菌群 乳酸菌 短链脂肪酸 复杂碳水化合物 全基因组测序
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R723.14
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-31
• 1.1 肠道菌群背景介绍12-18
• 1.1.1 肠道菌群的组成12
• 1.1.2 肠道菌群的功能12-14
• 1.1.3 肠道菌群与单纯性肥胖及相关代谢综合征的关系14-16
• 1.1.4 肠道菌群与遗传性肥胖的关系16-17
• 1.1.5 肠道菌群中的关键细菌的作用17-18
• 1.2 乳杆菌和双歧杆菌的背景介绍18-20
• 1.2.1 乳杆菌18
• 1.2.2 双歧杆菌18-19
• 1.2.3 双歧杆菌发酵利用碳水化合物的能力19-20
• 1.3 研究肠道菌群的相关技术20-21
• 1.3.1 变性梯度凝胶电泳指纹图谱技术20
• 1.3.2 ERIC-PCR指纹图谱技术20-21
• 1.3.3 16S rRNA基因测序技术21
• 1.3.4 肠道内乳杆菌和双歧杆菌的分离技术21
• 1.4 本论文的研究背景介绍21-24
• 参考文献24-31
• 第二章 遗传性肥胖儿童营养干预后肠道内优势菌的分离和鉴定31-47
• 引言31
• 2.1 材料和方法31-34
• 2.1.1 PWS儿童营养干预105天的粪便样品中优势菌的分离31-32
• 2.1.2 单菌分离物DNA的提取32
• 2.1.3 单菌分离物16S rRNA基因V3区PCR扩增和DGGE分析32-33
• 2.1.4 单菌分离物ERIC-PCR指纹图谱分析33
• 2.1.5 单菌分离物16S rRNA基因序列的测定和序列分析33-34
• 2.2 结果34-41
• 2.2.1 PWS儿童营养干预105天粪便样品中优势菌的分离结果34
• 2.2.2 单菌分离物与原始粪便样品 16S rRNA V3区PCR-DGGE图谱比对结果34-36
• 2.2.3 单菌分离物ERIR-PCR指纹图谱分型结果36-37
• 2.2.4 单菌分离物16S rRNA基因序列的分析结果37-40
• 2.2.5 乳杆菌分离物16S rRNA基因V3区PCR-DGGE图谱多条带现象的探究40-41
• 2.3 讨论41-43
• 本章小结43-44
• 参考文献44-47
• 第三章 遗传性肥胖儿童营养干预后肠道内优势菌生理功能的探究47-73
• 引言47
• 3.1 材料和方法47-50
• 3.1.1 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌生长曲线的测定47-48
• 3.1.2 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌上清发酵液p H的测定48
• 3.1.3 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌短链脂肪酸产生能力的测定48
• 3.1.4 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌上清发酵液抑菌能力的测定48-49
• 3.1.5 PWS儿童营养干预后肠道内双歧杆菌分离株碳水化合物利用能力的研究49-50
• 3.2 实验结果50-65
• 3.2.1 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌的生长曲线50-51
• 3.2.2 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌的短链脂肪酸产生能力51-53
• 3.2.3 PWS儿童营养干预后肠道内优势菌上清发酵液的抑菌能力53-55
• 3.2.4 PWS儿童营养干预后肠道内双歧杆菌分离株利用碳水化合物的能力55-65
• 3.3 讨论65-68
• 本章小结68-69
• 课题总结69-70
• 参考文献70-73
• 附录 1：PWS儿童营养干预后肠道内优势菌假小链双歧杆菌C95菌株全基因组序列的测定73-84
• 引言73
• 4.1 方法73-75
• 4.1.1 菌株的全基因组DNA的提取73
• 4.1.2 菌株的全基因组序列的测定及分析73-75
• 4.2 菌株全基因组的测定结果75-81
• 4.2.1 数据统计和质控结果75-76
• 4.2.2 样品reads的组装结果76-78
• 4.2.3 基因注释78-81
• 讨论81-83
• 参考文献83-84
• 附录 2：培养基和溶液试剂的配制84-85
• 附录 3：实验所用的主要仪器85-86
• 致谢86-88

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