1.中国广州地区G6PD缺乏症男性患儿的遗传学分析 2.G6PD基因与早期不明原因流产的关系探讨

发布时间：2017-08-21 07:13

  本文关键词：1.中国广州地区G6PD缺乏症男性患儿的遗传学分析 2.G6PD基因与早期不明原因流产的关系探讨

  更多相关文章： G6PD缺乏症 逆转录实时荧光定量PCR 绝对定量 基因型 基因表达量 G6PD 不明原因流产 绒毛

【摘要】：第一部分 中国广州地区G6PD缺乏症男性患儿的遗传学分析葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是红细胞磷酸戊糖途径中的关键酶,该途径能产生NADPH(还原型辅酶Ⅱ)以保护红细胞免受氧化物质的损伤。而葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症[OMIM:305900](G6PD缺乏症)是一种X连锁不完全显性的酶缺乏症,全球范围内约有4亿人受累,尤其是在热带和亚热带地区高发。在中国,G6PD缺乏症呈“南高北低”的分布趋势,主要集中在长江以南的地区,包括广东、广西、海南、云南等省份。该病临床症状多样,男性半合子G6PD活性呈显著性下降,而女性杂合子酶活性变化范围则较大,可呈显著性降低,也可在正常范围,因此我们选择了临床症状较统一的男性半合子做为研究对象。G6PD缺乏症大多由G6PD基因突变引起。该基因是一种看家基因,位于X染色体长臂(Xq28),长23182bp,含13个外显子和12个内含子,酶分子含545个氨基酸残基。截至2016年,在人类基因突变数据库(The Human Gene Mutation Database,HGMD)中查到的G6PD缺乏症致病基因总数为209种,其中错义突变及无义突变191种、基因调控区突变1种、剪切突变3种、小片段缺失10种、小片段插入2种、较大片段缺失2种。致病性突变可以导致G6PD活性水平降低,使红细胞容易受到外源性氧化剂攻击而引发损伤,进而导致红细胞溶解引起急性溶血性贫血。有报道显示,在G6PD缺乏症的高发地区,有近1/3的新生儿溶血是由G6PD缺乏引起的。考虑到不同的基因型所导致的临床表现不同,因此研究不同基因突变型的基因表达量及G6PD酶活性之间的相关性将有利于更深入地研究G6PD缺乏症的发病机制。中国人的G6PD缺乏症基因突变类型主要以c.1388 GA(G6PD Kaiping)、c.1376GT(G6PD Canton)、c.95 AG(G6PD Gaohe)、c.871GA(G6PD Viangchan)等错义突变为主,其中前两种基因型在中国常见基因型中占主要比例,均大于30%。因此,本研究通过构建G6PD基因的定量标准曲线,用于比较中国人群中常见的两种基因型(c.1376GT,c.1388GA)在酶活性和逆转录水平上的相关性。另外,G6PD基因11号外显子上c.1311CT的突变在中国人群中也十分常见,但是对于该突变是否致病仍存在争议。该基因突变常与IVSXI+93TC及rs1050757G呈连锁不平衡,以单倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G的基因型被检出,是由同义突变及SNPs组成。但有研究认为在亚洲人口中检测出该种单倍型与G6PD酶活性下降有一定的相关性。为证实此单倍型是否致病,本文欲通过对其c DNA的研究去分析G6PD单倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G是否因剪切突变而引起G6PD酶活性缺乏。[目的]:通过G6PD基因绝对定量法研究中国广东地区男性儿童常见突变基因型间表型及转录水平的关系,并通过对单倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G标本的c DNA测序分析,比对是否存在剪切位点改变进而引发疾病的可能。[方法]:收集正常对照及G6PD缺乏症患儿的血液标本共203例,提取其DNA进行基因型分析。将单倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G的c DNA标本和正常对照进行直接测序分析,并应用Cluster软件比对两者之间是否存在剪切位点的差异。另外对所有受试者的c DNA采用实时荧光定量PCR检测其G6PD基因表达量。用SPSS20.0版软件统计各基因型间表达量及酶活性比值的差异,并通过Western blot方法验证得到的表达量结果。以P0.05为差异具有统计学意义。[结果]:正常对照与G6PD缺乏症患儿(男孩)的G6PD基因表达量间差异有统计学意义(P0.05);不同基因型间(c.1376GT,c.1388GA及其他基因型)G6PD酶活性差异也有统计学意义(P0.05);但不同G6PD基因型间的基因表达量差异无统计学意义(P0.05)。在10例单倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G的标本中有8例检出了已知的致病性突变,但这10例均未发现剪切错误。[结论]:我们的实验结果不支持G6PD单倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/r s1050757G由于剪切而致病的推断。G6PD缺乏症患者较正常人的G6PD基因表达量有显著性降低,而基因型为G6PD c.1376 GT的患者会比c.1388 GA产生更为严重的临床表型。第二部分G6PD基因与早期不明原因流产的关系探讨早期自然流产是常见的病理性妊娠,其发生率在国内外均较高。目前,临床上有近半数的流产原因为染色体异常,而基因芯片的广泛应用为排除染色体异常所导致的自然流产提供了一个快捷的诊断平台,但仍有很多不明原因的自然流产存在。因此,对早期不明原因流产的根源研究仍需我们进一步探索。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症[OMIM:+305900]是一组最常见的人类酶缺陷综合征,全球范围内约有4亿人受累,尤其在热带和亚热带地区高发。在中国,G6PD缺乏症主要在广东、广西等南方地区高发。G6PD是磷酸戊糖途径的一个限速酶,它可以将G6P转变为6PG而伴随产生NADPH,而NADPH是体内维持氧化平衡的重要物质。因为G6PD缺乏症主要引发溶血性疾病(如新生儿溶血性贫血等),所以过往相关研究多集中于红细胞,但近年来越来越多的证据表明,G6PD缺乏症也会影响有核细胞的病理生理过程,包括调节细胞增殖、加速细胞衰老、增强细胞对病毒感染的敏感性而损害胚胎发育等等。同时,在以往的流行病学筛查中,G6PD基因的突变以点突变为多,并未发现大的缺失及移码突变,我们好奇这些未发现过的突变是否为致死性突变而引起负性自然选择?本文欲筛查不明原因流产绒毛标本中是否存在G6PD基因的大片段缺失及移码突变,然后与人工流产的绒毛标本基因测序结果相比较,通过本次研究探索G6PD基因与人类胚胎早期发育的关系,为临床上早期不明原因的自然流产寻找线索。[目的]:探讨G6PD基因与早期不明原因流产的关系。[方法]:对56例不明原因流产绒毛标本及30例正常绒毛标本进行G6PD基因测序。通过统计学分析(卡方检验)比较两组间的突变率差异。[结果]:在56例不明原因流产的绒毛标本中发现20例(33.9%)SNP,其中11例(19.6%)为c.1311CT/IVS XI+93TC单倍体型、6例(10.7%)为rs3216174、1例(1.8%)为rs200111236、1例(1.8%)为rs200729823;并发现1例(1.8%)错义突变,为c.1024CT。在30例正常绒毛标本中仅发现4例SNP(13.3%),均为c.1311CT/IVS XI+93TC单倍体型。两组SNP频率比较差异有显著性(χ2=4.86,P0.05)。[结论]:本研究在56例不明原因流产的病例中,发现存在较高频率的G6PD基因SNP位点,但未发现有移码突变和大片段缺失的病例标本。
【关键词】：G6PD缺乏症 逆转录实时荧光定量PCR 绝对定量 基因型 基因表达量 G6PD 不明原因流产 绒毛
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.8
【目录】：

• 第一部分中文摘要3-5
• 第一部分英文摘要5-8
• 第二部分中文摘要8-10
• 第二部分英文摘要10-14
• 第一部分 中国广东地区G6PD缺乏症男性患儿的遗传学分析14-46
• 引言14-17
• 第一章 实验材料17-20
• 1.1 研究对象17
• 1.2 主要试剂17-19
• 1.3 主要实验仪器19-20
• 第二章 实验方法20-30
• 2.1 基因组DNA、RNA、cDNA的制备20-21
• 2.2 基因型检测21-22
• 2.3 剪接位点的比对22-23
• 2.4 G6PD基因标准曲线的建立23-26
• 2.5 BIO-RAD荧光定量检测26-27
• 2.6 G6PD基因的Western blot27-28
• 2.7 统计学分析28-30
• 第三章 实验结果30-39
• 3.1 基因分型结果30
• 3.2 G6PD单倍型c.1311C>T/IVS+1193T>C/rs1050757cDNA剪切点比对30-35
• 3.3 荧光定量PCR结果35-36
• 3.4 表达量统计学结果36-39
• 第四章 讨论39-42
• 4.1 G6PD基因型c.1311C>T/IVS+1193T>C/rs1050757G是否为致病性突变的分析39-40
• 4.2 G6PD基因型c.1376G>T及c.1388G>A的表达量比较40-42
• 第五章 结论42-43
• 参考文献43-46
• 第二部分 G6PD基因与早期不明原因流产的关系探讨46-62
• 引言46-48
• 第一章 实验材料48-50
• 1.1 研究对象48
• 1.2 主要试剂48
• 1.3 主要实验仪器48-50
• 第二章 实验方法50-54
• 2.1 基因组DNA的制备50
• 2.2 基因芯片检测及分析50-51
• 2.3 PCR扩增51-52
• 2.4 PCR扩增结果测序52-54
• 第三章 实验结果54-57
• 3.1 流产绒毛基因芯片筛查结果54
• 3.2 PCR产物的测序分析54-56
• 3.3 正常对照组与不明原因流产绒毛组测序结果比较56-57
• 第四章 讨论57-59
• 第五章 结论59-60
• 参考文献60-62
• 攻读学位期间发表的文章62-63
• 英文缩略词表63-64
• 本课题的科研资助64-65
• 致谢65

，

本文编号：711521