Toll样受体2调控吞噬和自噬及变应性气道炎症的分子机制研究

发布时间：2017-10-16 12:16

  本文关键词：Toll样受体2调控吞噬和自噬及变应性气道炎症的分子机制研究

  更多相关文章： 巨噬细胞 金黄色葡萄球菌 Toll样受体2 吞噬 自噬 c-Jun氨基末端激酶变应性气道炎症 天然免疫

【摘要】：Toll样受体(TLRs)是Ⅰ型跨膜蛋白家族,在体内主要负责感知入侵的病原体。到目前为止,已经确定发现的人类TLR家族有10个成员。它们调节的天然免疫反应被认为参与了多种感染和炎症性疾病的发病。本论文中,我们主要针对TLR2进行了两个方面的研究。1.TLR2介导的金黄色葡萄球菌刺激巨噬细胞吞噬和自噬信号通路的分子机制研究背景有报道显示,Toll样受体2(TLR2)能够参与金葡菌的识别,然而,在金葡菌感染的气道环境中,巨噬细胞是否能够激活吞噬和自噬反应予以应对,TLR2在巨噬细胞活化的天然免疫过程中所发挥的作用以及潜在的机制,目前尚未阐明清楚。研究目的1.研究金葡菌感染巨噬细胞过程中,相关吞噬和自噬信号的活化情况。2.探讨TLR2及下游潜在信号级联在金葡菌刺激巨噬细胞所诱导的吞噬和自噬过程中的作用。研究方法1.金葡菌刺激巨噬细胞不同时间信号分子表达及自噬的检测金葡菌刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.715min、30min、45min、60min、120min、 240min。采用Western Blot方法检测多种信号分子和自噬蛋白的表达；通过瞬时转染GFP-LC3质粒的方法,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬的水平。2.RNA干扰TLR2对巨噬细胞吞噬金葡菌及自噬诱导的影响评估TLR2 siRNA作用于RAW264.7细胞的同时,给予金葡菌刺激1h。吞噬试验观察细胞吞噬金葡菌；通过瞬时转染GFP-LC3质粒的方法,激光共聚焦显微镜观察细胞自噬的水平；同时,采用Western Blot方法检测吞噬和自噬蛋白的表达。3.靶向抑制JNK对巨噬细胞吞噬金葡菌及自噬诱导的影响评估JNK特异性抑制剂SP600125处理RAW264.7细胞的同时,给予金葡菌刺激1h。吞噬试验观察细胞吞噬金葡菌；通过瞬时转染GFP-LC3质粒的方法,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬的水平；同时,采用Western Blot方法检测吞噬和自噬蛋白的表达。研究结果1.金葡菌刺激巨噬细胞活化多种信号通路及自噬RAW264.7细胞在金葡菌刺激作用下,P-JNK、P-ERK、P-p38 MAPKs, MyD88, P-Akt, GTP-Rac1的表达显著增加,在活化的MAPKs中,仅有JNK磷酸化水平的升高是以一种时间依赖性方式进行的；与此同时,金葡菌刺激RAW264.7细胞明显上调了自噬蛋白Beclin-1和LC3-II的表达,以及细胞中GFP-LC3点状颗粒的表达数量。2.TLR2对巨噬细胞吞噬金葡菌以及金葡菌诱导的自噬至关重要在TLR2 siRNA作用下,RAW264.7细胞吞噬金葡菌的能力显著降低,金葡菌刺激诱导的P-Akt、GTP-Rac1吞噬蛋白以及P-JNK的表达显著下调,但不减弱ERK、 p38的磷酸化；给予RAW264.7细胞siRNA沉默TLR2,金葡菌刺激细胞活化的自噬蛋白Beclin-1和LC3-II的表达水平明显降低,细胞中GFP-LC3点状颗粒的表达数量也相应的减少。3.TLR2依赖的JNK信号通路参与巨噬细胞吞噬金葡菌以及金葡菌诱导的自噬JNK抑制剂作用RAW264.7细胞减弱了细胞吞噬金葡菌的能力,下调了金葡菌刺激诱导的吞噬蛋白P-Akt和GTP-Rac1的表达；给予RAW264.7细胞SP600125处理,金葡菌刺激细胞活化的自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达水平降低,细胞中GFP-LC3点状颗粒的表达数量也相应的减少。TLR2 siRNA和SP600125同时作用与TLR2 siRNA单独作用相比,并未进一步降低RAW264.7细胞吞噬金葡菌的能力以及金葡菌刺激细胞活化的自噬水平。研究结论1.金葡菌刺激巨噬细胞诱导了吞噬和自噬活化。2.TLR2通过JNK信号通路介导了金葡菌刺激巨噬细胞诱导的吞噬和自噬,是一种新的可能的天然免疫调节机制。2.靶向抑制TLR2基因敲除小鼠JNK信号对变应性气道炎症及自噬活化的影响研究背景据世界卫生组织(WHO)评估,全世界超过3亿人罹患支气管哮喘(简称哮喘)。目前,已有的TLR2激活的天然免疫反应在哮喘发病中的作用研究仍存在争议。另外,哮喘发病过程中自噬的发生情况也不十分清楚。考虑到是哮喘最具特征性的临床表现之一,TLR2在变应性气道炎症中的作用,和对相关自噬活化的影响及潜在的信号机制有待阐明。研究目的1.观察变应性气道炎症模型中TLR2的表达情况。2.探讨TLR2及下游潜在信号级联在小鼠变应性气道炎症及自噬活化中的作用。研究方法1.建立变应性气道炎症模型,检测野生型小鼠肺组织中TLR2的表达卵清蛋白(OVA)致敏和激发野生型小鼠。采用Western Blot方法检测野生型小鼠肺组织中TLR2的蛋白表达水平；通过免疫荧光的方法,荧光倒置显微镜观察野生型小鼠气道TLR2的表达。2.TLR2基因敲除对小鼠变应性气道炎症及自噬活化的影响评估OVA致敏和激发TLR2-/-小鼠。组织病理学分析小鼠气道表现,HE染色观察小鼠气道炎症表现,PAS染色观察小鼠气道杯状细胞增生及粘液分泌；瑞氏染色计数BALF中炎性细胞数目；ELISA检测小鼠血清中OVA sIgE, BALF中TNF-α、IL-10的水平。采用Western Blot方法检测小鼠肺组织中炎症信号分子和自噬蛋白的表达。3.靶向抑制JNK对小鼠变应性气道炎症及自噬活化的影响评估OVA致敏和激发小鼠的同时,给予JNK特异性抑制剂SP600125处理。组织病理学分析小鼠气道表现,HE染色观察小鼠气道炎症表现,PAS染色观察小鼠气道杯状细胞增生及粘液分泌；瑞氏染色计数BALF中炎性细胞数目；ELISA检测小鼠血清中OVA sIgE, BALF中TNF-α、IL-10的水平。采用Western Blot方法检测小鼠肺组织中炎症信号分子和自噬蛋白的表达。研究结果1.OVA诱导野生型小鼠肺组织中TLR2表达上调同对照组相比,OVA激发的野生型小鼠肺组织中TLR2表达水平显著增加,并且主要定位于支气管周围和肺泡壁。2.TLR2基因敲除明显缓解OVA诱发的小鼠气道炎症OVA激发条件下,TLR2-/-小鼠同野生型小鼠相比,血清中OVA sIgE水平显著降低,支气管周围炎性细胞浸润,管壁增厚,上皮杯状细胞增生,粘液分泌等气道炎症表现均有明显减弱；BALF中炎性细胞数量明显减少,TNF-α表达明显下调。3.TLR2基因敲除明显降低OVA诱导的小鼠肺组织炎症和自噬信号的活化水平OVA激发条件下,野生型小鼠肺组织中MyD88、Akt、NF-κB和MAPK (JNK、 ERK、p38)炎症信号以及自噬的活化水平增高。TLR2-/-小鼠同野生型小鼠相比,OVA诱导的肺组织P-JNK、P-Akt和P-p65炎症蛋白以及Beclin-1和LC3-Ⅱ自噬蛋白的表达水平显著减弱。4.抑制JNK减轻OVA诱发的小鼠气道炎症OVA激发条件下,SP600125处理的野生型小鼠同未干预野生型小鼠相比,血清中OVA sIgE水平降低,支气管周围炎性细胞浸润,管壁增厚,上皮杯状细胞增生,粘液分泌等气道炎症表现均有减弱；BALF中炎性细胞数量减少,TNF-α表达下调。SP600125处理的TLR2-/-小鼠同未干预TLR2-/-小鼠相比,OVA诱发的气道炎症表现并未进一步减弱。5.抑制JNK下调OVA诱导的小鼠肺组织炎症和自噬信号的活化水平SP600125处理的野生型小鼠同未干预野生型小鼠相比,OVA诱导的肺组织JNK、 Akt和NF-κB炎症信号的活化以及Beclin-1和LC3-Ⅱ自噬蛋白的表达水平减弱。SP600125处理的TLR2-/-小鼠同未干预TLR2-/-小鼠相比,OVA诱导的气道炎症及自噬信号的活化并未进一步下调。研究结论1.变应性气道炎症模型TLR2表达上调。2.TLR2通过JNK信号利于变应性气道炎症的发生,同时伴随自噬的活化,寻找到了一种新的可能的防治变应性气道炎症的信号靶点。
【关键词】：巨噬细胞 金黄色葡萄球菌 Toll样受体2 吞噬 自噬 c-Jun氨基末端激酶变应性气道炎症 天然免疫
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R56
【目录】：

• 中英文对照词表5-7
• 摘要7-12
• Abstract12-19
• 第一部分 TLR2介导的金黄色葡萄球菌刺激巨噬细胞吞噬和自噬信号通路的分子机制19-58
• 1. 引言19-20
• 2. 材料与方法20-34
• 3. 实验结果34-50
• 4. 讨论50-53
• 5. 参考文献53-58
• 第二部分 靶向抑制TLR2基因敲除小鼠JNK信号对变应性气道炎症及自噬活化的影响58-101
• 1. 引言58-59
• 2. 材料与方法59-76
• 3. 实验结果76-91
• 4. 讨论91-94
• 5. 参考文献94-101
• 下一步工作设想101-102
• 附录102-105
• 致谢105-107
• 综述 天然免疫识别受体TLRs在肺部炎症中的研究进展107-129
• 参考文献118-129

【参考文献】

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1 ;The role of Toll-like receptors in non-infectious lung injury[J];Cell Research;2006年08期

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本文编号：1042612