哮喘的免疫调节以及靶向治疗研究
本文关键词:哮喘的免疫调节以及靶向治疗研究
更多相关文章: 白介素17 哮喘 EMT 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 激素 治疗
【摘要】:支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)以及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症导致气道高反应性,通常出现广泛多变的可逆性气流受限,并引起反复发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状,多数患者可自行缓解或经治疗后缓解。全世界大约有3亿哮喘患,哮喘在全世界的患病率从1%到18%不等,中国约有3千万哮喘患者,是全球哮喘病死率最高的国家之一。伴随着全球工业化的进展以及环境污染的加重,哮喘的发病率和病死率一直居高不下。哮喘不仅会对患者甚至社会造成较大的经济负担,而且也会严重影响患者的生活质量。因此,探索哮喘的潜在发病机制,并针对性的开创有效的治疗策略具有重要的现实意义。传统观点认为,辅助性T细胞2型(Thelp cell2, Th2)相关细胞因子及其所促使的黏液分泌细胞增生、嗜酸性粒细胞浸润等病理变化参与过敏性哮喘的发病与维持,并与症状严重程度呈正相关;相反,辅助性T细胞1型(T help cell,Th1)分泌的γ干扰素(IFN-y)可以抑制Th2的增殖而发挥炎症抑制作用。Thl功能相对抑制、Th2功能相对亢进的Thl/Th2失衡,所导致的IgE合成增加及白介素4(IL-4)、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的产生是哮喘发病的主要机制,因此,Thl/Th2轴及其失衡被认为与哮喘的发病和进展关系最为密切。但是这一理论并不能解释所有类型哮喘的发病机制。传统意义上的Th2/嗜酸粒细胞相关因子介导的哮喘,约占哮喘发病的41%,而发病机制、病理特征与此不同的非嗜酸性粒细胞型哮喘约占59%,后者很难用Thl/Th2失衡这一观点解释。依据哮喘患者痰液、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)以及支气管肺组织中浸润的主要炎症细胞种类,可将哮喘分为嗜酸性粒细胞型以及非嗜酸性粒细胞型。Th17/IL-17的发现与研究完善了Th1/Th2轴失衡为哮喘发病机制这一传统观点,Th17细胞及其分泌的IL-17与哮喘,特别是重症哮喘或激素抵抗型哮喘之间的关系受到越来越多的重视,但是目前关于IL-17在哮喘中的免疫调节的认识并不统一。基于哮喘患者以及气道炎症动物模型的研究证明,慢性气道炎症疾病中IL-17通过多种炎症介质的表达而参与炎症细胞的迁移与活化,导致炎症反应的持续存在;但是也有文献证实在某些情况下IL-17在哮喘的发病中起到抑制作用。更为深入的研究IL-17对哮喘发病的免疫调节,有助于我们进一步明确哮喘的发病机制,探索有效的治疗策略。有规律的吸入低剂量激素治疗是目前控制哮喘最理想的一线治疗方法,不过也存在约10%哮喘患者需要吸入较大剂量激素,有1%的哮喘患者需要口服激素来控制哮喘发病,此类哮喘患者存在对激素治疗的依赖性。此外,有小部分哮喘患者对高剂量的口服激素产生部分或完全耐药,或者称之为激素抵抗。虽然这类患者只占整个哮喘群体的5%-10%,但其所花费的医疗资源占据50%左右。激素抵抗哮喘(steroid resistant asthma, SRA)虽所占比例较低,但其急诊就医率和住院率分别是轻中度哮喘患者的15倍和20倍,是导致哮喘治疗费用增加的主要原因之一。通常将诱导痰中的中性粒细胞达到一定水平者,称之为中性粒细胞型哮喘。关于不同哮喘类型的横断面研究发现,气道中以嗜酸性粒细胞聚集为主哮喘患者对于糖皮质激素治疗较为敏感;而那些气道内无嗜酸性粒细胞,甚至可能表现为中性粒细胞增高的患者,往往存在激素治疗效果不明显的情况。因此,探索出有别于的激素的可以有效治疗激素不敏感的中性粒细胞型哮喘的治疗方法有重要的临床意义。第一部分外源性白介素-17抑制骨髓嗜酸性粒细胞分化缓解过敏性气道炎症目的:通过骨髓嗜酸性粒细胞分化的角度探讨外源性IL-17在过敏性哮喘气道炎症发病过程中的效应及相关机制,同时探索IL-17对嗜酸性粒细胞存活及功能的影响。方法:野生型C57BL/6小鼠构建嗜酸性粒细胞型哮喘模型,气道滴注外源性的IL-17或IL-17中和抗体。获取肺泡盥洗液细胞,进行炎症细胞总数及分类计数;肺组织制备病理切片评估气道炎症细胞浸润及粘液分泌;ELISA检测血清炎症因子表达。流式细胞术(FACS)检测骨髓嗜酸性粒细胞及其祖细胞(EoP)水平,并了解IL-17对嗜酸性粒细胞凋亡的影响;明确IL-17对骨髓嗜酸性粒细胞分化相关转录因子或趋化因子受体表达的影响。体外诱导骨髓嗜酸性粒细胞分化并以IL-17干预,检测其分化程度、凋亡水平以及分化相关转录因子表达。利用IL-5过表达的NJ.1638小鼠,分选外周血嗜酸性粒细胞体外培养,了解IL-17对嗜酸性粒细胞分泌细胞因子功能的影响。结果:哮喘小鼠气道滴注外源性IL-17之后,气道炎症细胞浸润减少,骨髓嗜酸性粒细胞分化被抑制,其祖细胞(EoP)形成减少,但是嗜酸性粒细胞的凋亡未被影响。骨髓细胞体外诱导嗜酸性粒细胞分化过程被IL-17抑制,存活水平无变化。体内及体外实验中,IL-17下调了嗜酸性粒细胞分化相关的GATA-1、GATA-2及CCR3表达,而不是与该类细胞分化相关的细胞因子IL-3、IL-5、GM-CSF。IL-17亦未能影响嗜酸性粒细胞分泌细胞因子的功能。哮喘小鼠气道滴注IL-17中和抗体之后气道中的嗜酸性粒细胞募集增加。结论:本部分研究首次证明外源性IL-17缓解哮喘小鼠的气道炎症和气道高反应性可能是通过对嗜酸性粒细胞分化的抑制,减少了EoP的形成,进而缓解了炎症部位该类细胞的聚集,而不是通过对嗜酸性粒细胞的存活或者分泌细胞因子功能的影响。本研究也因此强调了在过敏性气道炎症中针对于嗜酸性粒细胞的分化抑制可以作为哮喘治疗的新的研究方向或策略。第二部分IL-17通过ROS介导的TGF-β1表达促进慢性气道炎症EMT过程目的:探索过敏性气道炎症中IL-17对于气道上皮细胞间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)过程的影响极其相关机制,对哮喘的发病以及进一步的有效治疗提供理论依据。方法:利用野生型与IL-17A (IL-17)敲除小鼠构建慢性气道炎症模型。获取肺泡盥洗液细胞,进行炎症细胞总数及分类计数,肺组织制备病理切片评估气道炎症细胞浸润及粘液分泌;免疫组化检测肺组织EMT相关蛋白以及氧化应激相关蛋白8-OHdG的表达;ELISA检测肺组织IL-17及TGF-β1表达并分析其相关性。人支气管上皮(HBE)细胞培养并以IL-17干预,免疫荧光及Q-PCR检测EMT标志a-SMA与N-Cadherin表达,FACS检测IL-17诱导的ROS水平;通过ROS抑制剂及TGF-β1抑制剂应用明确IL-17. ROS及TGF-β1三者在EMT过程中的关系。免疫组化对临床哮喘患者支气管上皮细胞标记IL-17、TGF-p1、α-SMA、N-Cadherin以及8-OHdG,并且分析IL-17与上述其它蛋白表达水平的相关性。结果:IL-17缺失的哮喘小鼠与野生型哮喘小鼠相比,气道炎症、粘液分泌、胶原沉积、EMT相关标志物(a-SMA. N-Cadherin).氧化应激(8-OHdG)表达得到缓解;肺组织IL-17与气道重构或EMT相关的关键细胞因子TGF-p1表达正相关。体外实验中,IL-17诱导HBE细胞表达α-SMA、N-Cadherin与TGF-β1,同时上调氧化应激ROS形成;TGF-β1抑制剂能够逆转IL-17诱导的α-SMA、N-Cadherin表达,而ROS抑制剂则同时会逆转IL-17诱导的α-SMA、N-Cadherin及TGF-β1表达。临床哮喘患者支气管上皮活检样本的免疫组化结果显示IL-17与TGF-β1. a-SMA、N-Cadherin以及ROS标志物8-OHdG表达水平正相关。结论:IL-17缺失的哮喘小鼠气道炎症及EMT过程缓解,IL-17通过诱导ROS的过量产生,进而上调TGF-β1的表达,最终促进慢性气道炎症中EMT的进展。第三部分Bcl-2抑制剂靶向诱导粒细胞凋亡缓解激素不敏感型气道炎症目的:研究气道炎症持续性存在的潜在机制,并探索出一种有别于激素的能够通过诱导炎症细胞凋亡而缓解气道炎症,特别是激素治疗抵抗的中性粒细胞型气道炎症的治疗策略。方法:构建嗜酸性粒细胞型及中性粒细胞型哮喘小鼠模型,收集肺泡盥洗液细胞培养,FACS检测激素或Bcl-2抑制剂ABT-737或ABT-199对嗜酸性粒细胞及中性粒细胞体外凋亡的影响。免疫组化及免疫荧光检测哮喘小鼠肺组织及泡盥洗液炎症细胞上Bcl-2表达水平。野生型及Bcl-2过表达小鼠构建哮喘模型,通过对不同时间点气道炎症细胞募集、炎症因子表达以及气道高反应性的检测,明确Bcl-2在炎症细胞存活和清除过程中的作用。分别构建嗜酸性粒细胞型及中性粒细胞型哮喘小鼠模型,给予激素治疗或ABT-737或ABT-199气道滴注,评价气道炎症、气道高反应性,FACS、免疫组化(activated-Caspase-9、cleaved-Caspase-3)检测炎症细胞凋亡。探索ABT-737或ABT-199对哮喘模型肺组织各类免疫细胞的调节。收集重症哮喘患者外周血进行培养,观察激素或ABT-737或ABT-199对粒细胞凋亡的影响。结果:激素在体内或体外均可诱导嗜酸性粒细胞的凋亡,而表现出对中性粒细胞的无效。气道炎症疾病中,炎症细胞不但在气道中募集增加,而且存活时间延长。气道炎症模型小鼠肺组织以及泡盥洗液粒细胞上的凋亡抑制蛋白Bcl-2表达增加;Bcl-2过表达小鼠哮喘模型气道炎症更为严重而且持续时间延长。Bcl-2的抑制剂ABT-737或ABT-199给予上述两种哮喘模型小鼠气道滴注给药之后,两种哮喘模型小鼠均表现出气道高反应性下降,气道炎症细胞募集减少,嗜酸性粒细胞或中性粒细胞凋亡增加,而气道上皮细胞并未受损。相比地塞米松而言,ABT-737或ABT-199可以明显诱导重症哮喘患者外周血粒细胞的凋亡。结论:凋亡抑制蛋白Bcl-2抑制剂ABT-737或者ABT-199气道局部给药是一种有较好应用价值的治疗哮喘的方法,特别是对于激素治疗抵抗的中性粒细胞型哮喘的治疗具有潜在的研究价值。
【关键词】:白介素17 哮喘 EMT 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 激素 治疗
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R562.25
【目录】:
- 致谢5-6
- 中文摘要6-11
- 英文摘要11-16
- 缩略语中英文对照16-19
- 第一部分 外源性白介素-17抑制骨髓嗜酸性粒细胞分化缓解过敏性气道炎症19-57
- 1.1 引言19-20
- 1.2 材料与方法20-41
- 1.3 结果41-51
- 1.4 讨论51-55
- 1.5 小结55-57
- 第二部分 IL-17通过ROS介导的TGF-β1表达促进慢性气道炎症EMT过程57-83
- 2.1 引言57-58
- 2.2 材料与方法58-68
- 2.3 结果68-79
- 2.4 讨论79-82
- 2.5 小结82-83
- 第三部分 Bcl-2抑制剂靶向诱导粒细胞凋亡缓解激素不敏感型气道炎症83-124
- 3.1 引言83-84
- 3.2 材料与方法84-96
- 3.3 结果96-119
- 3.4 讨论119-122
- 3.5 小结122-124
- 结论124-125
- 参考文献125-134
- 综述134-155
- 参考文献147-155
- 作者简介及在读期间所取得的科研成果155-156
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