体外条件下携带β-catenin基因的慢病毒载体转染大鼠BMSCs的实验研究

发布时间：2017-11-12 14:16

  本文关键词：体外条件下携带β-catenin基因的慢病毒载体转染大鼠BMSCs的实验研究

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【摘要】：背景 烟雾吸入性肺损伤(Smoke inhalation lung injury, SILI)是一种特殊类型的急性肺损伤(acute lung injure, ALI),它是火灾中幸存的烧伤患者的主要死因。具有起病急、发展快、病情重等特点,主要累及呼吸道、肺,病理表现为气管黏膜上皮变性,纤毛消失,黏膜下充血水肿,炎性细胞浸润以及肺泡破裂融合,肺泡腔渗出、出血,肺血管内皮坏死,血栓等。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)由于其多项分化潜能而备受关注,多项研究报道在体外及体内条件下BMSCs可增殖分化为肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells, AEC)对损伤的肺泡上皮进行修复,但其分化机制尚不清楚,且增殖效率低。我们前期的研究发现烟雾吸入性肺损伤大鼠肺组织内经典Wnt信号通路激活,β-catenin是此信号通路的核心成分,本研究正是在此基础上,观察β-catenin对BMSCs增殖的影响。 目的 构建β-catenin过表达的慢病毒载体(lentiviral vector, LV),转染293T细胞并进行包装病毒,纯化病毒感染大鼠BMSCs,使得β-catenin在BMSCs内高表达,并探讨β-catenin对BMSCs增殖能力的影响。 方法 1.运用全骨髓贴壁培养法分离、培养大鼠BMSCs,在倒置显微镜下观察细胞形态,用CCK-8法绘制大鼠BMSCs的生长曲线,并进行成脂及成骨诱导分化,分别用油红O及茜素红对其进行染色鉴定。 2.构建β-catenin过表达的LV,转染293T细胞进行病毒包装,并对病毒进行浓缩,在96孔板中进行感染BMSCs的预实验,明确不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)条件下,含β-catenin基因的LV的转染效率,摸索出转染效率较高而对细胞毒性最小的病毒浓度条件,之后分为五组：转染含β-catenin基因的LV的BMSCs (A组：MOI=10；B组：MOI=25)、转染阴性对照病毒的BMSCs(C组：MOI=10)、聚凝胺(polybrene)+BMSCs(D组)、BMSCs(E组),通过PCR检测β-catenin在BMSCs中的表达情况,通过CCK-8法检测细胞增殖活力。 结果 1.BMSCs贴壁生长,呈细长的纺锤形,类似成纤维细胞外形。细胞生长曲线呈S形,加入成脂诱导液诱导72h后,细胞内有小脂滴出现,约2周后脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形,油红O染色显示有大量脂质沉淀。加入干细胞成骨诱导液,诱导培养3天后,细胞体积增大,呈短梭形；诱导第7天,细胞呈多角形,胞质内细胞颗粒增多；14天,胞质内充满颗粒,细胞呈集落样生长,细胞间可见钙质沉积；21天,细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构,钙结节形成明显,经茜素红染色呈红色结节。 2.构建的β-catenin LV滴度为2.00E+8TU/ml。当MOI=25时,流式细胞仪检测转染目的基因的BMSCs在转染后96h时感染效率大约为76%。且PCR检测到β-catenin的mRNA在BMSCs中过表达。 3.D、E两组贴壁后,第1-2天,细胞生长相对较慢,3-5天,细胞生长较快,进入对数生长期,之后细胞生长速度减慢,生长逐渐停滞,且两组之间无明显差异(P0.05)。慢病毒转染的BMSCs,其生长均受到抑制,与D、E组相比,从第2天开始其生长速度明显减慢(A、B、C组分别与D组相比,组间差异均具有显著统计学意义,P0.001)。C组与A、B组相比,从其生长速率进一步下降(C组分别与A、B组相比,从第3天开始,组间开始出现统计学意义,P0.05,第4天以后具有明显统计学意义,P0.001)。而A、B两组相比,BMSCs的生长速率无明显差异。 结论 1.应用全骨髓贴壁培养法成功获得大鼠BMSCs。 2与空载对照组相比,利用慢病毒感染至β-catenin过表达可促进大鼠BMSCs的增殖。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.8

【参考文献】

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本文编号：1176246