酪氨酸磷酸酶SHP2在过敏性气道炎症的嗜酸性粒细胞分化中的作用机制研究

发布时间：2017-11-14 10:00

  本文关键词：酪氨酸磷酸酶SHP2在过敏性气道炎症的嗜酸性粒细胞分化中的作用机制研究

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【摘要】：背景：哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,主要表现为可逆性的气道高反应性,气道炎症细胞的浸润,尤其是以气道嗜酸性粒细胞大量浸润为典型特征。嗜酸性粒细胞在哮喘中还表现为一种关键的效应性细胞,很多研究表明哮喘的严重程度是和嗜酸性粒细胞的活化以及数量增多呈正相关的。而且研究还发现过敏性支气管哮喘患者骨髓中的嗜酸性粒细胞水平明显增高。嗜酸性粒细胞从骨髓中发育而来,在趋化因子如Eotaxin的作用下进入血液并迁移至肺部组织从而发挥炎症反的作用。小鼠的嗜酸性粒细胞是从粒单核细胞系祖细胞(GMPs)分化为中间状态的嗜酸性粒细胞祖细胞(EoPs)后再由EoPs分化而来,而对于人类来说,嗜酸性粒细胞祖细胞则是从共同髓系祖细胞或者其上游的多潜能祖细胞产生的。在嗜酸性粒细胞祖细胞表面表达有IL-5Rα,这是EoPs区别于GMPs的重要特征,而这也意味着IL-5能够促进嗜酸性粒细胞祖细胞分化为嗜酸性粒细胞,而不是在GMPs分化为EoPs的过程中起作用。酪氨酸磷酸酶SHP2是一种广泛表达的胞内蛋白,包括两个SH2结构域和一个具有催化功能的酪氨酸磷酸酶结构域。SHP2在很多重要的生理活动中起作用。研究发现SHP2能参与很多信号通路,介导T细胞的发育,可通过刺激CEBPα基因的表达而调控了细胞因子依赖的粒细胞产生过程。正常的SHP2功能在维持胚胎干细胞的稳态以及造血干祖细胞池的动态稳定中起着重要的作用。而近期的研究也发现SHP2在香烟烟雾诱导的肺部炎症反应中也有重要的作用。我们实验室在之前的研究中发现在小鼠气道上皮中条件性敲除shp2基因能有效降低TGF-β1的产生从而在哮喘慢性气道重构中起作用,且在哮喘小鼠气道慢性重构模型的BALF中嗜酸性粒细胞水平明显减少。那么SHP2除了可作用于气道上皮之外,在哮喘的发病过程中是否也能作用于骨髓嗜酸性粒细胞的产生及分化过程呢?嗜酸性粒细胞在哮喘的发生发展中起着关键性的作用,因此深入研究嗜酸性粒细胞分化过程中的具体机制也显得尤为重要。因此,本课题的研究重点是酪氨酸磷酸酶SHP2是否能影响嗜酸性粒细胞的产生和分化过程,又是如何在嗜酸性粒细胞分化过程中发挥调控作用的。通过给予SHP2特异性抑制剂PHPS-1及利用带重组酶Cre的腺病毒实现体外敲除shp2以及构建特异性髓系shp2敲除的小鼠进行体内和体外研究,我们发现SHP2在骨髓失活或者敲除后能明显减少哮喘小鼠气道中的嗜酸性粒细胞水平,有效缓解肺部嗜酸性粒细胞性气道炎症,降低气道高反应性,而这都是与SHP2直接抑制骨髓中嗜酸性粒细胞的分化密切相关的。而这些实验结果也提示SHP2在嗜酸性粒细胞分化过程中可能是一个重要的调控因子,因此有可能成为未来哮喘治疗的一个有效靶点。具体研究分为三大部分：(1)SHP2在哮喘小鼠气道炎症和骨髓嗜酸性粒细胞产生中的作用研究； (2)SHP2在嗜酸性粒细胞分化过程中的调控作用研究；(3)髓系敲除shp2在哮喘小鼠嗜酸性粒细胞性气道炎症和骨髓嗜酸性粒细胞分化中的调控作用。第一部分SHP2在哮喘小鼠气道炎症和骨髓嗜酸性粒细胞产生中的作用研究目的：构建卵清蛋白诱导引起的急性哮喘小鼠模型,探索SHP2在哮喘小鼠嗜酸性粒细胞性气道炎症中的作用及其作用机制。方法：6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠按体重大小编号,根据随机数字表产生随机数字,按照随机数字大小分组,将实验小鼠平均分为SHAM+PBS组、SHAM+PHPS-1组、OVA+PBS组和OVA+PHPS-1组。SHAM组给予PBS致敏雾化,PHPS-1组给予小鼠PBS或者OVA致敏和雾化,并在雾化前1小时腹腔注射PHPS-1 (5mg/kg)。观察各组小鼠肺泡支气管灌洗液中细胞总数、细胞分类计数和病理学检测；采用荧光定量PCR检测肺组织Th2型炎症因子的表达；采用ELISA的方法检测肺组织匀浆中炎症因子的表达；检测外周血和骨髓细胞中嗜酸性粒细胞比例和数量的改变；采用流式细胞术方法检测骨髓中EoPs和GMPs的比例和数量的改变。在末次抗原激发后24小时收集小鼠骨髓细胞进行嗜酸性粒细胞克隆形成试验和检测GATA-1 mRNA水平。结果：本实验利用卵清蛋白致敏雾化构建急性哮喘小鼠模型。通过对SHAM+PBS组和OVA+PBS组的BALF细胞数、肺组织病理学以及炎症因子表达等多项指标的检测,符合急性哮喘模型的特征,提示造模成功。通过雾化前1小鼠腹腔注射PHPS-1,与OVA+PBS组相比,PHPS-1干预哮喘小鼠之后,BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞比例和绝对数量均有明显下降(P0.001);肺组织病理学HE染色结果提示：PHPS-1干预哮喘小鼠之后明显减少支气管和血管之间的炎症细胞浸润,支气管上皮增生肥厚现象也明显改善(P0.01);肺组织病理学PAS染色结果提示：PHPS-1干预后能明显抑制抗原诱导的肺组织内粘液分泌增多,表现为PAS阳性颗粒数明显减少(P0.001);肺组织炎症因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达下调(P0.05);肺组织匀浆中炎症因子IL-4和IL-13的蛋白表达也下调(P0.05);流式细胞术检测骨髓中嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞祖细胞的水平也明显减少(P0.05),但不影响GMPs的水平以及骨髓嗜酸性粒细胞的体内凋亡水平；外周血中嗜酸性粒细胞数量同样减少,但不改变外周血中IL-5的水平。结论：PHPS-1对急性哮喘小鼠的嗜酸性粒细胞性气道炎症具有保护作用,其可能机制是下调炎症因子,减少炎症细胞在肺内的浸润,并减少骨髓嗜酸性粒细胞的产生；而抑制嗜酸性粒细胞产生的可能机制并不是通过影响嗜酸性粒细胞的凋亡,而可能是通过抑制嗜酸性粒细胞祖细胞的水平或者嗜酸性粒细胞的分化过程而实现的。第二部分SHP2在嗜酸性粒细胞分化过程中的调控作用研究目的：研究体外抑制或者敲除shp2在小鼠骨髓嗜酸性粒细胞分化和凋亡中的作用机制。方法：提取野生型小鼠骨髓非粘附单个核细胞(NAMNCs)进行嗜酸性粒细胞体外分化实验,在培养第4天体外给予20uM PHPS-1,在不同分化时间通过流式检测嗜酸性粒细胞水平以及凋亡,并检测不同分化时间SHP2蛋白水平,GATA-1和MBP mRNA水平,同时检测嗜酸性粒细胞克隆形成单位(Eos-CFU)。利用腺病毒Ade-Cre-GFP体外敲除shp2后观察Eos-CFU、嗜酸性粒细胞数量和GATA-1 mRNA水平。并提取野生型小鼠骨髓流式分选lineage阴性细胞,在G-CSF的刺激下诱导中性粒细胞分化,并在培养过程中给予不同浓度的PHPS-1,研究SHP2在中性粒细胞分化过程中的作用。结果：在体外实验中,无论PHPS-1干预或腺病毒介导的shp2敲除后骨髓的Eos-CFU皆明显下降,嗜酸性粒细胞在不同分化时间的比例也显著下降,而GATA-1 mRNA表达水平明显抑制,皆有统计学意义(P0.05)。而PHPS-1体外干预后嗜酸性粒细胞分化过程明显受抑制,但不影响嗜酸性粒细胞的凋亡。结论： SHP2参与骨髓嗜酸性粒细胞的分化过程,而该作用可能是通过作用转录因子GATA-1实现的。阻断SHP2能有效抑制骨髓嗜酸性粒细胞的分化,但对分化过程中的嗜酸性粒细胞凋亡则并无明显作用。第三部分 髓系敲除shp2在哮喘小鼠嗜酸性粒细胞性气道炎症和骨髓嗜酸性粒细胞分化中的调控作用目的：研究髓系shp2敲除后对哮喘小鼠骨髓嗜酸性粒细胞分化和哮喘气道炎症的调控机制。方法：利用Lysmcre shp2flox/flox小鼠建立急性哮喘模型,在末次抗原激发后24小时收集小鼠BALF进行细胞分类计数,肺组织HE和PAS染色,研究髓系敲除shp2的哮喘小鼠气道和肺部炎症改变。同时利用Lysmcre shp2flox/flox小鼠骨髓进行体外诱导嗜酸性粒细胞分化,检测嗜酸性粒细胞的水平及相关信号通路。并在野生型小鼠骨髓嗜酸性粒细胞分化过程中给予Erk抑制剂U0126后检测嗜酸性粒细胞水平。结果：与shp2flox/flox哮喘小鼠相比,Lysmcre shp2flox/flox哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞数量显著下降,肺组织病理学结果提示髓系shp2敲除的哮喘小鼠中支气管和血管之间的炎症细胞浸润明显减少,肺组织内粘液分泌增多受到抑制,肺组织炎症因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达下调(P0.05)。而通过体外诱导嗜酸性粒细胞分化的研究发现,髓系shp2敲除后的骨髓细胞在嗜酸性粒细胞体外分化过程中p-Erk的表达明显下降,且Erk抑制剂U0126同样能抑制嗜酸性粒细胞的分化过程,提示SHP2调控嗜酸性粒细胞的分化过程可能是通过调控p-Erk实现的。结论：髓系shp2敲除后可明显缓解哮喘小鼠的嗜酸性粒细胞性气道炎症,抑制肺部炎症细胞浸润以及粘液高分泌,并能抑制骨髓嗜酸性粒细胞的分化,提示SHP2在嗜酸性粒细胞分化过程中起着重要的调控作用,而其作用机制可能是通过调控Erk信号通路而实现。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25
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本文编号：1184909