脂多糖协同多聚左旋精氨酸诱导NCI-H292细胞分泌IL-6、IL-8的JNK信号通路研究

发布时间：2017-11-19 14:11

  本文关键词：脂多糖协同多聚左旋精氨酸诱导NCI-H292细胞分泌IL-6、IL-8的JNK信号通路研究

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【摘要】：目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)协同多聚左旋精氨酸(Poly-L-arginine,PLA)诱导NCI-H292细胞分泌白介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-8的信号通路机制。方法:1.细胞培养用常规培养基(10%胎牛血清+90%RPMI1640培养液)体外培养NCI-H292细胞,置于37℃、5%CO2环境的培养箱内孵育,根据细胞生长状态,一般每3-4天传代1次。取最佳生长状态的细胞,以约3×105/500μl的密度接种于24孔细胞培养板中。2.Western Blot检测JNK磷酸化水平按照实验设计,将NCI-H292细胞分为PLA(5μg/ml)组、LPS(5μg/ml)组、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)组,每组刺激时间分别为0、15min、30min、45min、60min、90min、120min,采用Western Blot检测各组细胞在不同时间点的JNK、p-JNK蛋白含量,以β-actin作内参,并分析比较不同时间点的p-JNK/JNK比值;将NCI-H292细胞分为空白对照组、PLA(5μg/ml)组、LPS(5μg/ml)组、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)组,采用Western Blot检测比较各组细胞内的JNK、p-JNK蛋白含量,并比较JNK信号通路特异性抑制剂SP600125(30μM)作用前后对JNK磷酸化的影响。3.ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)检测细胞因子IL-6、IL-8按照实验设计,将NCI-H292细胞分为空白对照组、PLA(5μg/ml)组、LPS(5μg/ml)组、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)组、PLA(5μg/ml)+SP600125(30μM)组、LPS(5μg/ml)+SP600125(30μM)组、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)+SP600125(30μM)组和SP600125(30μM)组,根据实验分组要求先加入JNK信号通路特异性抑制剂SP600125,在37℃、5%CO2的培养箱内孵育,预先刺激2h后,再加入PLA或/和LPS。共同培养24h后收集细胞上清液,按照ELISA试剂盒检测各组的IL-6和IL-8表达情况,比较各组间存在的差异。4.统计学处理所有实验均重复3次。采用SPSS17.0统计软件处理、分析实验数据,数据用?x±s表示,单因素方差分析(One-Way ANOVA)用于多组间的比较;LSD(least significant difference)检验用于两两间比较方差齐时,方差不齐时采用Dunnett,s T3检验。P0.05为差异有统计学意义。结果:1.PLA作用NCI-H292细胞一定时间(15min、30min、45min、60min、90min、120min)后JNK磷酸化水平均增加,与空白对照组比较具有统计学差异(P均0.01),且JNK磷酸化随时间延长而增加,45min达到高峰(P0.001)后下降。2.LPS作用时间为15min、30min、45min、60min、90min、120min时,JNK磷酸化水平较空白对照组均增加,差异有统计学意义(P均0.05),与PLA类似的是45min之前呈上升趋势,45min为JNK磷酸化高峰(P0.01),45min后为下降趋势。3.PLA+LPS作用NCI-H292细胞15min、30min、45min、60min、90min、120min,JNK磷酸化水平较空白对照组显著增加,并具有统计学意义(P均0.001),PLA+LPS的作用高峰提前至30min(P0.01),45min时较前下降(P0.001),在60min时再次增加后减少(P0.001),30min的JNK磷酸化水平高于60min,差异有统计学意义(P0.01)。4.PLA+LPS组的JNK磷酸化水平显著高于PLA组或LPS组,PLA+LPS组与PLA组、LPS组之间的差异具有统计学意义(P均0.001)。5.SP600125能明显减少PLA或/和LPS刺激NCI-H292细胞的JNK磷酸化水平增加(P均0.001)。6.与空白对照组比较,PLA组、LPS组和PLA+LPS组的NCI-H292细胞内IL-6和IL-8的表达明显增加(P均0.01),并且PLA+LPS组明显高于PLA组或LPS组(P均0.001);SP600125能明显抑制PLA组、LPS组和PLA+LPS组的NCI-H292细胞表达IL-6、IL-8(P均0.01)。结论:1.PLA、LPS能激活NCI-H292细胞内的JNK信号通路,并且两者具有协同效应。2.LPS能协同PLA促进NCI-H292细胞分泌IL-6和IL-8。3.JNK信号通路参与LPS协同PLA诱导NCI-H292细胞分泌IL-6、IL-8的过程。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R562.25

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本文编号：1203814