人羊膜匀浆上清液对脂多糖诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤保护作用研究

发布时间：2017-11-24 17:10

  本文关键词：人羊膜匀浆上清液对脂多糖诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤保护作用研究

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【摘要】：目的(1)观察不同浓度的人羊膜匀浆上清液(human Amniotic Homogenates Supernatant, hAHS)对体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar Type Ⅱ cell, AT-Ⅱ)增殖的影响。(2)探讨hAHS对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)致大鼠AT-Ⅱ损伤后细胞增殖的保护作用及自身表达促炎细胞因子的影响。方法(1) hAHS的制备及其总蛋白与相关因子含量的测定：取健康剖宫产产妇胎膜,PBS冲洗,于无菌条件下剥离人羊膜,同时鉴定其活力。将活力大于95%的人羊膜剪碎后放入EP管,按体积比1：1加入专用培养基匀浆,转移匀浆液并按体积比1：5加入专用培养基后离心,离心后取上清液用细菌过滤器过滤,收集滤液,即得到用于细胞培养的hAHS,-80℃冻存备用。参照上述方法,将过程中的专用培养基用PBS替代,制得用于细胞因子检测的hAHS,并用考马斯亮蓝法检测其总蛋白含量,ELISA法检测细胞因子EGF、 bFGF、 HGF、 IL-4、 IL-10、 HBD2的含量。(2)观察不同浓度hAHS对体外培养的大鼠AT-Ⅱ增殖的影响：将第一代AT-Ⅱ培养至90%融合后消化并以2×104cell/mL密度接种于96孔板,每孔200μL,孵育24h,经饥饿处理后弃培养液,按分组更换培养基,并隔天换液。根据培养基配方不同而分为五组(各配方中FBS、hAHS、专用培养基的浓度均指其占培养基总体积的百分数)：0%hAHS组为10%FBS+90%专用培养基,10%hAHS组为10%FBS+80%专用培养基+10%hAHS, 20%hAHS组为10%FBS+70%专用培养基+20%hAHS,40%hAHS组为10%FBS+50%专用培养基+40%hAHS,80%hAHS组为10%FBS+10%专用培养基+80%hAHS。分别于每组第一次更换培养基后的第0(当天)、1、3、5、7天用MTT法检测各孔的OD值、绘制生长曲线、计算各组细胞增殖率。(3) hAHS对LPS诱导AT-Ⅱ损伤的保护作用：培养第一代AT-Ⅱ至融合度为90%时消化,以1×105cell/mL密度接种于96孔板,每孔200μL。孵育24h,经饥饿处理后,按分组更换培养基。根据培养基、LPS及hAHS配比不同分为五组(各组培养基中FBS、 hAHS、专用培养基的浓度均指其占培养基总体积的百分数,LPS浓度均指培养基中LPS的终浓度)：FBS组(对照组)10%FBS+90%专用培养基,hAHS组10%FBS+50%专用培养基+40%hAHS,LPS组10%FBS+90%专用培养基+40μg/mL LPS, LPS+hAHS组10%FBS+50%专用培养基+40%hAHS+40μg/mL LPS。按照实验分组更换培养基后的第0(当天)、24、48、72h用MTT法检测细胞OD值,第2、4、6、12、24h收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测各组细胞培养上清液中鼠源性IL-1β、TNF-α的含量。结果(1) hAHS中总蛋白含量为(725.125±12.625)mg/L,其中部分细胞因子含量分别为：EGF(504.785±4.665)、bFGF(4.426±0.138)、HGF(20.763±3.396)ng/L,IL-4(25.650±4.104) ng/L、IL-10 (13.733±2.197) ng/L、Ang-1 (15.561±0.496) ng/L、HBD2 (4.763±0.714) ng/L。(2) hAHS促进AT-ⅡI增殖实验中,各组生长曲线趋势为——对照组第1天处于停滞期,第3、5、7天处于对数期；10%组只有短暂的停滞期,第1、3、5、7天处于对数期；20%和80%组相似,经过短暂的停滞期后,第1、3、5天处于对数期,第7天处于平稳期；40%组只有短暂的停滞期,第1、3、5、7天处于对数期。各组OD值相比——实验组各组的OD值在第1、3、5、7天都大于对照组(C组)且有统计学差异(P0.05)。10%hAHS浓度组的OD值在第1、3、5、7天小于40%hAHS浓度组且有统计学差异(P0.05),在第3、5、7天小于20%、80%hAHS浓度组且有统计学差异(P0.05)。20%hAHS浓度组的OD值在第3、5天小于40%hAHS浓度组且有统计学差异(P0.05),在第1、3、天小于80%hAHS浓度组,其中在第3天有统计学差异(P0.05),在第5、7天大于80%hAHS浓度组,其中在第7天有统计学差异(P0.05)。40%hAHS浓度组的OD值在第1、3、5天均大于其他实验各组,其中40%hAHS浓度组的OD值在第1、3、5天大于10%hAHS浓度组且有统计学差异(P0.05),40%hAHS浓度组的OD值在第3、5天大于20%、80%hAHS浓度组且有统计学差异(P0.05)。各组细胞增殖率相比——10%组的增值率在第1、3、5、7天小于40%组且有统计学差异(P0.05)。20%组的增值率在第3、5天小于40%组且有统计学差异(P0.05)。80%组的增值率在第3、5、7天小于40%组且有统计学差异(P0.05)。(3) hAHS对LPS致伤的保护实验中：hAHS组在第24、48、72h的OD值高于FBS组,有统计学差异(P0.05)；IL-1β、TNF-α的含量在各时间点与FBS组相比无统计学差异(P0.05)。LPS致伤组在第48、72h的OD值低于FBS组,具有统计学差异(P0.05)；IL-1p的含量在第2、4小时高于FBS组,且具有统计学差异(P0.05),TNF-α的含量在第2、4、6、12小时均高于FBS组,且具有统计学差异(P0.05)。LPS+hAHS组在第24、48、72h的OD值高于LPS组,具有统计学差异(P0.05)；IL-1β的含量在2、4小时低于LPS组(P0.05),TNF-α的含量在第2、4、6、12小时低于LPS组,且具有统计学差异(P0.05)。结论(1) hAHS检测到了EGF、 bFGF、 HGF、 IL-4、 IL-10、 HBD2。(2) hAHS对体外培养的大鼠AT-Ⅱ增殖有明显的促进作用,浓度为40%时有最佳的促进效果。(3) hAHS对LPS诱导大鼠AT-Ⅱ损伤后AT-Ⅱ的增殖具有保护作用,并可降低LPS诱导AT-Ⅱ损伤后自身产生的促炎因子IL-1β、TNF-α的表达。
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563

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本文编号：1222975