肺结核病生物学标志物的筛选与鉴定及易感基因研究

发布时间：2017-11-27 12:10

  本文关键词：肺结核病生物学标志物的筛选与鉴定及易感基因研究

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【摘要】：第一部分非耐药肺结核病生物学标志物的筛选与鉴定研究背景：结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的慢性传染性疾病,以肺部结核最为常见。临床普遍应用的肺结核病诊断金标准为痰细菌学检测,诊断时间须4-8周。为此,无法早期控制传染源,导致肺结核病发病率和死亡率的上升。目前,尚无肺结核病的生物学标志物,无法建立高效的诊断肺结核病的新方法。研究方法：本研究收集血清431例,其中150例健康对照、131例非耐药肺结核病患者、91例抗结核药物治疗2个月患者、59例抗结核药物治疗6个月以上(治愈)患者。我们通过iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa测序技术筛选了非耐药肺结核病患者初诊、治愈组和健康对照组各10例样本,分析血清蛋白组学和转录组学的生物学标志物的差异。应用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和荧光定量PCR大样本验证选取的差异蛋白质和miRNAs。通过ROC曲线分析、Logistic回归模型,建立非耐药肺结核病的潜在诊断乃至疗效评价模型。研究结果：通过iTRAQ-2D LC-MS/MS技术,在初诊非耐药肺结核病患者中,发现了35个和健康对照、抗结核治疗后均差异的蛋白质；通过Solexa测序技术发现同趋势改变的miRNAs 64个。以健康对照组为参照,初诊未用药和抗结核治愈的肺结核病患者之间,存在差异最大的Gene Ontology分类是：代谢途径(13)；细胞器(13)和催化活性(7)。差异蛋白质多存在于补体和凝血途径、吞噬体等通路。对57例初诊非耐药肺结核病、53例抗结核治疗2个月样本、59例治愈样本和60例健康对照组进行ELISA和荧光定量PCR验证发现,ALB、ARHGDIB、 FCN2、miR-92a-3p、miR-125a-5p和miR-148b-3p可以作为非耐药肺结核病的潜在诊断标志物,并且由他们组成的非耐药肺结核病诊断模型正确率为94.37%；疗效评价模型的正确率为85.33%。结论：(1)建立了iTRAQ-2D LC-MS/MS蛋白组学检测联合Solexa转录组学测序-整合分析-ELISA、SYBR green荧光定量PCR验证的肺结核病血清标志物检测平台；(2)筛选并验证获得非耐药肺结核病的标志物：ALB、ARHGDIB、FCN2、 miR-92a-3p、miR-125a-5p和miR-148b-3p;(3)建立了灵敏度为94.12%,特异性为94.59%的非耐药肺结核病Logistic回归诊断模型；同时,建立了灵敏度为79.41%,特异性为90.24%的疗效评价模型。本课题的研究结果,为非耐药肺结核病早期诊断和疗效评价,提供了实验室依据。第二部分耐多药肺结核病生物学标志物的筛选与鉴定研究背景：肺结核病(Pulmonary Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染肺部引起的慢性传染性疾病。根据感染的Mtb的耐药性,肺结核病可分为非耐药肺结核病(drug-sensitive tuberculosis,DS-TB)和耐药肺结核病。对异烟肼、利福平两种一线药物均耐药的称为耐多药肺结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)。 I临床普遍应用的耐多药肺结核病的诊断方法存在耗时长、敏感性低等缺陷。为此,迫切需要建立一种快速、敏感、高效的诊断耐多药肺结核病的新方法。然而,目前尚无耐多药肺结核病的生物学标志物。研究方法：本研究收集血清323例,其中150例健康对照、131例非耐药肺结核病患者、42例耐多药肺结核病患者。我们通过iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa测序技术筛选了耐多药肺结核病、非耐药肺结核病患者和健康对照组各10例(包括生物学重复)血清蛋白组学和转录组学的差异。进一步应用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和荧光定量PCR大样本验证选取的差异蛋白质和miRNAs。通过ROC曲线分析和决策树模型,建立耐多药肺结核病的潜在诊断模型。研究结果：我们通过iTRAQ-2D LC-MS/MS技术,发现了50个在耐多药肺结核病患者中和非耐药肺结核病、健康对照均存在显著差异的蛋白质。通过Solexa测序技术发现差异miRNAs43个。进一步整合分析发现,11个差异蛋白质和14个差异miRNAs间可形成调控网络,且该网络成分大多参与补体和凝血途径。我们通过靶基因预测发现有调控关系的3对miRNAs-蛋白质：miR-4433b-5p-CD44、 miR-424-5p-F11和miR-199b-5p-KNG1,验证结果表明以上6个小分子在耐多药肺结核病组较非耐药肺结核病组和健康对照组存在显著差异(P0.05),且miR-199b-5p和KNG1间存在负相关。由这些小分子组成的耐多药肺结核病决策树诊断模型的敏感度100.00%,特异度88.33%；十折交叉验证结果发现模型正确率为83.33%。结论：(1)应用iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa测序技术筛选了耐多药肺结核病的差异蛋白质和差异miRNAs。发现其中11个差异蛋白质和14个差异miRNAs间可形成调控网络；(2)通过ELISA和SYBR green qRT-PCR验证获得了耐多药肺结核病潜在诊断标志物：CD44、F11、KNG1、miR-4433b-5p、miR-424-5p和miR-199b-5p;(3)建立了敏感度100.00%,特异度88.33%的决策树模型,为耐多药肺结核病临床早期诊断,提供了新的资料。第三部分CTLA4基因单核苷酸多态性与肺结核病易感性的关联研究研究背景：根据世界卫生组织调查报告,尽管世界上有三分之一的人感染过结核分枝杆菌,但只有5-15%的人会发病,提示个体差异在肺结核病的易感中起了极大的作用。课题组前期研究发现,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与肺结核病易感性存在相关。结核分枝杆菌感染可导致机体免疫系统激活。细胞毒性T细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4, CTLA4)是细胞免疫中关键的免疫负调节因子。现已发现CTLA4+49位点(rs231775)、+6230位点(rs3087243)、11430位点(rs11571319)与一些自身免疫疾病易感性相关,且能影响CTLA4抑制细胞免疫活性。研究方法：本实验应用PCR扩增和DNA测序技术,采用病例-对照方法,检测了中国汉族人群274例肺结核病患者和266例健康对照血样CTLA4+49位点(rs231775)、+6230位点(rs3087243)和11430位点(rs11571319)的基因型及等位基因频率。并应用Haploview 4.2软件进行连锁不平衡分析及单体型分析。进一步根据美国结核病协会(National Tuberculosis Association,NTA)分类法对肺结核病患者进行轻、中、重度分组；根据CT/X线胸片对肺结核病患者进行单／双肺损害分组,揭示CTLA4 SNPs与肺结核病易感及病理损伤的相关性。研究结果：研究发现CTLA4基因3个SNPs位点的等位基因频率在肺结核病组和健康对照组之间没有显著性差异(P0.05)。但是,在肺结核病患者中,CTLA4 +49 AG基因型频率(38.42%)显著低于健康对照组(49.77%),并与肺结核病易感性呈负相关(P=0.038,95%C10.436-0.978)。连锁不平衡分析发现,发现CTLA4+49位点和+6230位点之间有强连锁不平衡现象(D0.075,r20.3)。单体型分析发现,健康对照组+49A/+6230G/11430G单体型出现频率(0.069)明显高于肺结核病组(0.014,P0.0001,95%C10.072-0.468)。进行NTA分类后,等位基因频率、基因型频率和单体型均无显著差异(P0.05)；而进行单／双肺损害分析后,发现+49G/+6230G/11430A单体型与双肺损伤密切相关(P-=0.018)。结论：(1)采用病例-对照方法及统计学分析,首次对CTLA4基因+49、+6230、11430位点与肺结核病的易感性进行了关联研究；(2)CTLA4的+6230和11430位点SNPs与中国汉族肺结核病易感性不相关,而+49AG基因型可降低个体感染肺结核病的风险,是保护性位点；(3)+49A/+6230G/11430G单体型为健康对照的保护性单体型,+49G/+6230G/11430A单体型与双肺损伤密切相关。研究为阐明肺结核病的发病易感性与病理改变机制提供了新的实验依据。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R521
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本文编号：1231785