香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究

发布时间：2017-11-27 14:00

  本文关键词：香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究

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【摘要】：在人类57种CYP450酶中,仅有十几个酶负责外源化学物的代谢,这些代谢酶存在组织特异性,人细胞色素P450 2A13 (CYP2A13)是一种主要在呼吸系统中表达的肝外代谢酶。前期研究发现,CYP2A13高效代谢活化AFB1生成多种代谢产物,与I)NA、RNA和蛋白质等生物大分子结合形成加合物,引发细胞毒性、炎症、DNA损伤、肿瘤等毒效应。吸烟导致呼吸道损伤,而长期吸烟易高发肺癌,NNK和尼古丁是香烟烟雾中公认的CYP2A13底物,研究表明NNK可经CYP2A13的代谢活化导致小鼠肺癌的发生。尼古丁是香烟烟雾抽提物(CSE)中含量最多的物质,约占CSE总含量的1%。研究表明,尼古丁及其代谢产物介导的物质毒性相对较低,但可能导致CYP2A13的急剧消耗,进而抑制CYP2A13对香烟烟雾其他物质的代谢活化。前期研究发现,去除尼古丁可导致CYP2A13介导的CSE毒性显著增强,由于NNK在CSE中的含量很低,因此推测CSE中可能存在含量相对较高的CYP2A13新底物。为此,本研究利用标准参比烟3R4F,采用经高效液相色谱系统结合已经建立的稳定表达人CYP2A13的BEAS-2B细胞(B-2A13),解析CSE中与CYP2A13代谢活化相关组分,并进一步分离、纯化和鉴定,试图发现CYP2A13的新底物；然后利用体外代谢反应进一步确定与CYP2A13代谢相关的单体；再利用B-2A13和B-2A5细胞以及CYP2A5敲除小鼠(CYP2A5-/-),系统阐明CYP2A13在代谢活化候选单体所致呼吸道损伤中的作用,明确CYP2A13与候选CSE组分单体的关系。研究结果不仅可为吸烟所致呼吸系统损伤的机制研究提供新的研究策略,也可为控制吸烟并寻找切实可行的预防控制措施提供依据,有望为环境空气污染物／致癌物的健康风险评估提供可行的技术支撑。第一部分CSE中CYP2A13的新底物5-HMF的发现与鉴定目的：利用色谱技术结合细胞毒性评价,初步筛选CSE中与CYP2A13代谢相关的组分,并利用质谱和核磁共振技术鉴定出候选化学物。方法：利用HPLC将CSE分离及通过B-2A13与B-V细胞毒性筛选毒性组分、候选组分的进一步分离、纯化后采用GC-MS/MS、NMR、HPLC鉴定,运用纯品进行B-2A13与B-V细胞代谢毒性验证,并与标准品进行毒性比对确认。结果：(1)利用HPLC将CSE分为尼古丁部分和非尼古丁部分,结果发现,非尼古丁部分对B-2A13细胞的毒性显著增强,4%浓度时的细胞活力仅10%左右,且可被CYP酶抑制剂8-MOP所逆转,而尼古丁部分的毒性较弱；(2)按照CSE在HPLC中的保留时间按每10min收集为4组,分别处理B-2A13细胞和B-V细胞,结果发现前10min的组分细胞毒性最强,而含NNK的组分(10-20 min)并未显示出明显毒性；将前10min组分按每分钟收集再处理细胞,发现5min段的组分细胞毒性最强； (3)将5min段的CSE组分进行再分离、纯化、浓缩后进行鉴定,GC-MS/MS显示该组分单体在4.88min处有明显的吸收峰,结合离子特征和数据库,推定可能为5-羟甲基糠醛(5-HMF); NMR的检测结果也证明,该物质与5-HMF的结构极为相似； (4)无论是HPLC检测还是细胞毒性实验,均显示该物质与5-HMF标准品完全一致。结论：CSE中存在CYP2A13的新的底物,该物质极有可能是5-HMF,且可被CYP2A13代谢活化增强其细胞毒性。第二部分CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性研究目的：构建体外代谢反应体系,评价CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性,明确两者间的代谢关系。方法： (1)为了获得有蛋白活性的CYP2A13,建立了POR与CYP2A13蛋白在Baculovirus/sf9中共表达的体系： 首先通过分子克隆构建pFastBac-dual-POR-CYP2A13质粒,再运用DH10Bac大肠杆菌将其转化为杆状病毒)NA (Bacmid-POR-CYP2A13),然后将杆状病毒DNA转化入sf9细胞产生CYP2A13-POR的病毒液并表达有代谢活性的CYP2A13和POR蛋白。(2)采用western b1 ot检测CYP2A13和POR蛋白的表达、经CO差示光谱法和细胞色素C还原法分别检测CYP2A13和POR蛋白的活性、以NNK为代谢底物检验共表达CYP2A13和POR蛋白的代谢能力。(3)将制备的CYP2A13蛋白用于5-HMF的代谢研究中,分析其代谢产物,评价其代谢动力学和代谢活性。结果：(1)采用Baculovirus/Sf9系统体外联合表达CYP2A13和POR蛋白,免疫印迹结果显示,所获得的微粒体蛋白中存在较明亮的CYP2A13和POR蛋白的特异性条带,提示联合表达成功；(2)经CO差示光谱法和细胞色素C还原法,CYP2A13活性为0.62 pmol/min/pmol蛋白,POR蛋白的活性为38.9nmol/min/mg蛋白；采用CYP2A13的经典底物NNK进行验证,结果显示表达的CYP2A13可显著代谢NNK生成其代谢产物NNAL,代谢动力学结果显示其代谢活性为：Vmax (pmol/min/pmol):2.5±0.4; Km (μM):12.0±2.6; Vmax/Km：0.208；进一步提示所表达的CYP2A13表达具有良好的代谢活性； (3)CYP2A13可在120min内将5-HMF完全代谢生成其代谢产物5-HMFA;代谢动力学结果显示其代谢活性为：Vmax (pmol/min/pmol):2.7±0.2; Km (μM): 50.9±8.3; Vmax/Km:0.05;结果提示CYP2A13对5-HMF有较好的代谢活性。结论：体外成功地表达了具有较好活性的CYP2A13和POR蛋白,5-HMF是CYP2A13的新的底物。第三部分CYP2A13/CYP2A5对CSE中5-HMF所致呼吸毒性的影响目的：通过动物实验,初步阐明CYP2A13在代谢5-HMF及其所致小鼠呼吸系统急性损伤中的作用。方法：小鼠CYP2A5与人CYP2A13同源,两者在功能上非常接近,由于同步构建的人源化CYP2A13小鼠未能在呼吸系统检测到CYP2A13蛋白,因此采用同期构建的CYP2A5敲除小鼠(CYP2A5-/-)进行功能研究。(1)为评价CYP2A5与CYP2A13在代谢活化5-HMF中的功能差异,先利用pLJM慢病毒体系构建稳定表达CYP2A5的BEAS-2B细胞(B-2A5)；经鉴定构建成功后,检测其5-HMF的代谢毒性,并与B-2A13细胞的代谢毒性相比较。 (2)5-HMF鼻腔滴注染毒CYP2A5-/-小鼠以及野生型小鼠,通过病理学检查比较两者的鼻腔、肺损伤；通过检测肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞数量与种类以及炎症因子的表达比较两者肺部炎症情况。结果：(1)经GFP验证,拟构建的B-2A5细胞绿色荧光明亮、充满,转染效率接近100%； (2)细胞毒性结果显示,5-HMF对B-2A5和B-2A13细胞的毒性基本一致,且都可以被8-MOP所逆转,提示CYP2A5对5-HMF也具有相近的代谢活化作用； (3)动物实验显示,5-HMF处理的野生型小鼠可见鼻中隔粘膜结构破损断裂、纤毛脱落,大量嗜酸性粒细胞浸润,而CYP2A5-/-小鼠的纤毛结构完整、上皮细胞排列整齐；野生型小鼠的肺部炎症明显、肺泡壁细胞显著增厚,而CYP2A5-/-小鼠肺的炎症不明显；5-HMF处理的野生型小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞显著高于5-HMF处理的CYP2A5-/-小鼠,肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6、TNF-α的浓度也显著升高。结论：CYP2A5可显著介导5-HMF的呼吸毒性,由于CYP2A5与CYP2A13的同源性以及对5-HMF代谢活化作用的一致性,因此可以推断CYP2A13可以通过代谢活化5-HMF导致呼吸系统的急性损伤。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R56

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本文编号：1232062