游离二氧化硅诱导大鼠肺成纤维细胞转分化过程中基因组甲基化水平

发布时间：2018-02-23 18:03

  本文关键词： 游离二氧化硅 甲基化 成纤维细胞 转分化　出处：《郑州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：转分化是指一种分化完全的细胞在某些因素的刺激下,丢失其原有的表型特点而转变为其他类型细胞,是一种特定的生理或病理过程。在矽肺发生过程中,游离二氧化硅刺激肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage,AM)分泌各类活性介质,尤其是转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1、TGF-β1),诱导肺成纤维细胞(Lung fibroblast,LF)转分化为肌成纤维细胞(Myo fibroblast,MF),其α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及胶原蛋白的表达上调,且凋亡受到抑制,促进细胞增殖和胶原合成,最终引起肺纤维化。游离二氧化硅刺激成纤维细胞转分化过程中涉及大量基因和蛋白的改变,以往传统遗传学研究尚未解释其确切机制。与传统遗传学相比,表观遗传学的改变更常见,而且其改变是可逆的。表观遗传学调控在其他纤维化中的成纤维细胞转分化过程中发挥了重要作用,且有可能成为作为逆转转分化或降低转分化程度的干预靶点。所以研究矽肺纤维化中成纤维细胞转分化的表观遗传学调控机制具有十分重要的意义。 目的 通过建立肺纤维化体外细胞模型,模拟游离二氧化硅诱导大鼠肺成纤维细胞转分化的过程,检测基因组的甲基化水平,甲基转移酶和甲基结合蛋白的mRNA及蛋白水平的表达情况。为扩展对肺纤维化发生发展规律的认识提供表观遗传学实验基础,并为肺纤维化疾病的研究提供新的思路。 方法 1.矽肺纤维化体外细胞模型建立。采用ThinCertTM共培养模型,肺灌洗获取巨噬细胞；胰蛋白酶消化法分离和纯化肺成纤维细胞,在37℃、5%CO2条件下进行培养。取4-8代的成纤维细胞接种于6孔板内,细胞融合至80%-90%时,在ThinCertTM内接种约3×105个巨噬细胞,悬挂于6孔板的孔内进行共培养。间接培养模型,游离二氧化硅刺激巨噬细胞后的上清液,经离心后加入接种有成纤维细胞的6孔板内,在37℃、5%CO2条件下进行进行共培养。 2.肺成纤维细胞转分化鉴定。将游离二氧化硅均匀混入无血清DMEM培养基中,终浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml,经模型共培养后,对成纤维细胞进行检测。Real-Time PCR检测α-SMA、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ,COL Ⅰ)及Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ,COL Ⅲ)的mRNA水平；ELISA法测定α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ的蛋白表达水平。 3.成纤维细胞的基因组甲基化水平检测。用无血清的游离二氧化硅为刺激物,以0μg/ml为空白组,处理组分别加入25μg/ml、50gg/ml、100gg/ml浓度的游离二氧化硅,培养24h。DAC组以5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,DAC)3μmol/L预处理成纤维细胞24h后,在ThinCertTM内加入100μg/ml浓度的游离二氧化硅,培养24h。成纤维细胞提取基因组总DNA经水解后,采用高效液相色谱法测定基因组DNA中的脱氧胞苷(Deoxycytidine,dC)和5-甲基脱氧胞苷(5-Methyl-2'-deoxycytidine,5-dmC)的含量。 4.DNA甲基化相关酶基因转录及蛋白表达的检测。Real-Time PCR检测DNA甲基转移酶1(DNA(cytosine-5)-methyltransferase1,DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNA(cytosine-5)-methyltransferase3a,DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNA(cytosine-5)-methyltransferase3b,DNMT3b)、甲基结合结构域蛋白2(Methyl-CpG binding domain protein2,MBD2)和甲基CpG结合蛋白2(Methyl CpG binding protein2,MeCP2)的mRNA水平；ELISA法测定DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2和MeCP2的蛋白表达水平。 结果 1.显微镜下观察分离培养的SD大鼠胸腔巨噬细胞、肺成纤维细胞体外生长良好,可以用于体外实验研究,模型中细胞也生长正常,可用于实验。 2.肺成纤维细胞转分化鉴定：ThinCertTM共培养模型中,游离二氧化硅处理组的细胞α-SMA、COL Ⅰ和COL Ⅲ的表达明显高于0μg/ml组(P0.05),且随游离二氧化硅浓度增高,肺成纤维细胞表达α-SMA、COL Ⅰ和COL Ⅲ的量也逐渐增多。与间接共培养模型相比,各组别的细胞α-SMA、COL Ⅰ和COL Ⅲ的表达均高于间接共培养相同组别。 3.基因组DNA中的dC和5-dmC的含量的检测结果：与0μg/ml组(5.53%±0.044%)相比,25μg/ml(4.30%±0.067%)、50μg/ml(3.86±0.062%)、100μg/ml(3.50%±0.036%)游离二氧化硅剂量组成纤维细胞的基因组甲基化水平分别降低22.2%、30.2%、36.7%,差异具有统计学意义(P0.05)；与100μg/ml游离二氧化硅剂量组相比,DAC组(2.78%±0.065%)DAC处理后成纤维细胞基因组甲基化水平降低20.6%,差异具有统计学意义(P0.05)。 4.甲基化相关酶和甲基结合蛋白的mRNA及蛋白表达的检测结果：与0gg/ml组细胞相比,25μg/ml组细胞DNMT1的mRNA的表达水平无明显改变,差异无统计学意义(P0.05)；50μg/ml、100μg/ml和DAC组细胞分别降低18.7%、27.6%、42.1%和64.4%,差异有统计学意义(P0.05)。 与0μg/ml组细胞相比,25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和DAC组细胞DNMT3a的mRNA的表达水平分别降低14.5%、29.5%、38.5%和52.2%,差异有统计学意义(P0.05)。 与0μg/ml组细胞相比,DAC组细胞DNMT3b的mRNA的表达水平降低35.5%,差异有统计学意义(P0.05)；其它组细胞无明显变化,差异没有统计学意义(P0.05)。 与0μg/ml组细胞相比,25μg/ml、50μg/ml组细胞MBD2的mRNA的表达水平无明显改变,差异无统计学意义(P0.05)：100μg/ml和DAC组细胞分别降低14.5%和56.8%,差异有统计学意义(P0.05)。 与0μg/ml组细胞相比,DAC组细胞MeCP2的mRNA的表达水平降低71.5%,差异有统计学意义(P0.05)；其它组细胞无明显变化,差异没有统计学意义(P0.05)。 各基因的蛋白表达水平和mRNA的表达水平具有一致性。与0μg/ml组细胞相比,游离二氧化硅处理组细胞DNMT1、DNMT3a和MBD2的蛋白水平的表达有所降低；DAC组细胞表达最低；DNMT3b和MeCP2的蛋白水平表达无明显变化。 结论 1.利用ThinCertTM小体改良后的体外细胞共培养模型建立成功,用于矽肺研究中游离二氧化硅诱导肺成纤维细胞转分化的实验。 2.矽肺体外共培养细胞模型中,成纤维细胞基因组甲基化水平在游离二氧化硅作用下,在DNMT1、DNMT3a和MBD2的调节下呈剂量依赖性降低。
[Abstract]:The expression of 伪 - smooth muscle actin ( 伪 - SMA ) and collagen is up - regulated in the process of pulmonary fibrosis . Purpose By establishing an in vitro cell model of pulmonary fibrosis , the expression of methylation level , mRNA and protein level in lung fibroblasts induced by free silica was simulated . method 1 . In vitro cell model of silicotic fibrosis was established . The lung fibroblasts were isolated and purified by using ThinCertTM co - culture model and lung lavage . The cells were cultured under the condition of 37 鈩，

本文编号：1527082