气道上皮细胞BEAS-2B中人抗原R对上皮间质转化调控作用的研究

发布时间：2018-03-02 01:11

  本文关键词： 人抗原R 上皮间质转化 锌指E盒结合蛋白1 香烟烟雾提取物　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种在世界范围内都有颇高发病率、病死率的呼吸道疾患。2017年更新的慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)指南中指出,C0PD是一种由有毒的颗粒或气体损伤气道及肺组织而引起的疾病,不再单独提及慢性炎症反应这一因素。在发病机制描述方面,指南除肯定了氧化应激、蛋白酶破坏、炎症反应等先前的共识外,非炎症机制对C0PD发病的重要性得到人们的日益关注。非炎症机制包括转化生长因子-β(TGF-β)活化、Wrt信号转导异常和E-钙粘蛋白流失等,以上机制同时与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生密切相关。EMT是指上皮细胞经过一系列变化后最终转变为具有间质细胞特点细胞的过程。研究表明,EMT与组织纤维化、组织重塑、肿瘤发生以及肿瘤侵袭转移等病理改变有关。有证据显示,EMT与包括C0PD在内的多种纤维化肺疾病存在密切关系。EMT作为COPD发病的潜在机制,在气道重塑、纤维化甚至恶变中都发挥了作用,具有重要的研究价值。EMT的调控涉及诸多信号通路、转录因子,共同构成了复杂的调控网络,临床药物研究多针对单一途径,很难达到调控目的。人抗原R(human antigen R,HuR)是一种广为研究的RNA结合蛋白,可以与多种蛋白的信使RNA(mRNA)结合,并通过影响其稳定性或者翻译过程发挥相应的生物学作用。研究表明,HuR参与了多种EMT相关细胞因子的调控,但是在COPD中,HuR是否参了与EMT的调控以及能否通过调控HuR来影响EMT进程目前尚无有关报导。目的:本文旨在明确HuR在C0PD患者气道上皮中的表达水平,以及在香烟烟雾提取物(CSE)刺激的气道上皮BEAS-2B中的表达及活性情况,在细胞水平探讨HuR对EMT的调控作用。方法:免疫组织化学法检测人肺脏组织气道上皮中HuR的表达情况,并量化分析与患者一秒用力呼气容积(FEV1)的相关性,实验分为对照不吸烟组、对照吸烟组、C0PD吸烟组;实验室培养人气道上皮细胞株(BEAS-2B),采用香烟烟雾提取物(CSE)刺激方式模拟C0PD致病状态,蛋白印迹法检测不同CSE刺激条件下HuR表达水平;蛋白印迹法、免疫荧光法检测HuR活性,根据CSE刺激时间,实验分为对照组、3小时组、6小时组和9小时组;采用小RNA干扰技术抑制HuR表达,分别应用定量实时荧光PCR及蛋白印迹法检测抑制表达效率;CSE刺激BEAS-2B及干扰HuR表达后,蛋白印迹法、免疫荧光法检测E-钙粘蛋白、波形蛋白表达情况,应用光学显微镜观察BEAS-2B细胞形态变化,实验主要分为对照组、CSE组和CSE+HuR干扰组;干扰HuR表达后,检测EMT关键转录因子锌指E盒结合蛋白1(ZEB-1)的mRNA衰减速率,CSE刺激及干扰HuR表达后,检测ZEB-1表达变化。结果:(1)C0PD患者肺脏气道上皮细胞中HuR表达增高免疫组织化学结果显示,C0PD吸烟组中HuR表达显著高于对照不吸烟组及对照吸烟组,对照吸烟组HuR表达高于对照不吸烟组;HuR表达水平与FEV1存在负相关性。(2)CSE刺激下BEAS-2B细胞系中HuR表达增高、活性增强BEAS-2B细胞中,CSE刺激促进HuR的表达;蛋白印迹及免疫荧光结果显示,CSE刺激后,HuR细胞质分布增加,活性增强。(3)小RNA干扰可明显降低HuR表达水平BEAS-2B中转染3组小RNA序列,分别在RNA水平及蛋白水平检测HuR表达,有2组序列HuR表达均有明显的下调。(4)CSE刺激下BEAS-2B细胞系中HuR在EMT调节中发挥作用BEAS-2B细胞中CSE处理后,细胞出现EMT相关改变,E-钙粘蛋白(上皮细胞标志物)表达降低,波形蛋白(间叶细胞标志物)表达升高,细胞形态有梭形改变;抑制HuR表达后,EMT标志物及细胞形态改变均得到部分逆转。(5)HuR介导ZEB-1的调控BEAS-2B细胞中,与对照相比,HuR干扰后ZEB-1的mmRNA稳定性降低,降解速度增快;CSE刺激促进ZEB-1表达,抑制HuR表达后,ZEB-1表达水平降低。结论:HuR在COPD患者气道上皮组织中高表达,同时在CSE刺激的气道上皮BEAS-2B中表达及活性上调。在BEAS-2B中,HuR参与了对EMT的调控,并对EMT关键转录因子ZEB-1有调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.9

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本文编号：1554379