mTOR信号通路参与肺纤维化发病的机制研究

发布时间：2018-03-07 02:27

  本文选题：肺纤维化　切入点：雷帕霉素　出处：《北京协和医学院》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景： mTOR信号通路是细胞内调节细胞增殖、生存、凋亡等重要功能的信号途径之一,目前研究表明该通路与多种纤维化疾病相关。特发性肺纤维化(IPF)是一种致死性的缺乏有效药物治疗的慢性肺病,有研究提示mTOR信号通路异常可能与特发性肺纤维化发病相关,但具体机制尚不明确。 研究目的： 研究肺肌成纤维细胞及肺泡上皮细胞内mTOR信号通路活化情况在肺纤维化发病中的作用,探讨mTOR特异性抑制剂雷帕霉素对肺纤维化形成过程的干预,并阐述其发挥作用的可能机制。 研究方法： 1.在IPF患者肺组织中,使用免疫组织化学染色方法,检测反映mTOR通路活化的效应蛋白p-S6在肺组织内的表达情况； 2.在野生C57BL/6小鼠中,应用单次气管内注射博来霉素的方法建立小鼠肺纤维化模型,用免疫组织化学染色方法来检测此模型小鼠肺组织中p-S6的表达情况； 3.从正常肺组织中分离原代肺成纤维细胞(primary lung fibroblast, PLF)做体外原代细胞培养,在TGF-β1刺激下,肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,检测此过程中p-S6的表达变化情况； 4.应用一种人胚胎肺成纤维细胞系(MRC5)做细胞培养,在TGF-β1刺激下,成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,检测此过程中的p-S6表达变化情况； 5.通过转基因及基因敲除的技术方法建立一种在肺泡上皮内特异性TSC1基因敲除的小鼠动物模型,使得该小鼠2型肺泡上皮细胞内mTOR信号通路过度活化,应用此种基因敲除小鼠来进行博来霉素所致肺纤维化模型的构建,评估在肺泡上皮内mTOR过度活化情况下对肺纤维化形成的影响； 6.在野生C57BL/6小鼠中,使用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素来干预博来霉素所致的肺纤维化过程,分别使用了雷帕霉素预处理(气管给药前第5天)及雷帕霉素后期治疗(气管给药后第8天)两种干预方式,主要评估药物干预下的小鼠体重、死亡率及肺组织病理损伤的变化情况； 7.在野生C57BL/6小鼠中,联合使用雷帕霉素和氯喹(作为一种自噬抑制剂)的预处理方式干预博来霉素所致的肺纤维化过程,观察小鼠死亡率情况,并使用WB蛋白检测及电镜观察方式来评估小鼠肺组织内的自噬水平变化情况。 研究结果： 1.p-S6在IPF患者肺组织成纤维细胞灶中的肌成纤维细胞内明显高表达； 2.p-S6在博来霉素所致肺纤维化模型的小鼠纤维化病变肺组织中明显高表达; 3.体外细胞培养实验中,成纤维细胞(包括人肺组织原代培养的肺成纤维细胞和人胚胎肺成纤维细胞)在TGF-β1的刺激下均可转分化为肌成纤维细胞(a-SMA表达升高),此过程中p-S6表达明显升高。 4.在小鼠肺组织中,肺泡上皮细胞内TSC1基因敲除能导致肺泡上皮细胞内mTOR信号通路过度活化,肺泡上皮内mTOR活化能加重博来霉素所致小鼠肺组织病理损伤和死亡； 5.雷帕霉素预处理干预方式能有效改善博来霉素所致的肺病理损伤并降低死亡率,雷帕霉素后期处理干预方式不能改善博来霉素所致的肺病理损伤及不能降低死亡率； 6.联合使用雷帕霉素和氯喹预处理干预方式同单纯使用雷帕霉素预处理干预相比,能加重博来霉素所致的小鼠死亡；博来霉素所致肺纤维化的小鼠肺组织中自噬水平下降,雷帕霉素干预能促进肺组织中的自噬水平,氯喹则降低其自噬水平。 实验结论： 1.肺纤维化发病时肺内肌成纤维细胞的形成过程中伴随着mTOR信号通路的活化。 2.肺组织肺泡上皮内mTOR信号通路活化参与肺纤维化发病。 3. mTOR抑制剂雷帕霉素对博来霉素诱导的肺纤维化过程能起到一定的抑制作用。 4.肺纤维化时自噬水平低下,雷帕霉素可能是通过抑制mTOR信号通路和促进自噬的机制来发挥治疗作用。
[Abstract]:Research background:
MTOR signal pathway is the regulation of cell proliferation, cell survival, one of the important functions of the signal pathway of apoptosis, the present study shows that the pathway and a variety of fibrotic diseases. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lack of effective drug for the treatment of chronic lung disease, a study suggests possible and idiopathic pulmonary fibrosis the incidence of abnormal mTOR signal pathway, but the mechanism is not clear.
The purpose of the study is:
Objective to investigate the role of activation of mTOR signaling pathway in pulmonary fibroblasts and alveolar epithelial cells in the pathogenesis of pulmonary fibrosis, and to explore the intervention of rapamycin, a specific inhibitor of mTOR, on the formation process of pulmonary fibrosis, and to expound the possible mechanism of its action.
Research methods:
1. in the lung tissue of IPF patients, immunohistochemical staining was used to detect the expression of the effector protein p-S6, which reflected the activation of the mTOR pathway in the lung tissue.
2. in the wild C57BL/6 mice, a single lung endotracheal injection of bleomycin was used to establish the mouse pulmonary fibrosis model. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of p-S6 in the lung tissue of the model mice.
3., primary lung fibroblast (PLF) from primary lung tissue was isolated from normal lung tissues and cultured in vitro, and TGF- fibroblasts were transformed to myofibroblast stimulated by TGF- 1, and the expression of p-S6 in the process was detected.
4., a human embryonic lung fibroblast cell line (MRC5) was used for cell culture. Fibroblasts were differentiated into myofibroblasts under the stimulation of TGF- beta 1, and the expression of p-S6 in the process was detected.
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本文编号：1577557