RA及IL-24对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖及转分化的影响

发布时间：2018-03-27 13:48

  本文选题：肺泡Ⅱ型上皮细胞　切入点：肺泡Ⅰ型上皮细胞　出处：《滨州医学院》2015年硕士论文

【摘要】：目的：探讨分离、纯化、培养原代胎鼠肺泡II型上皮细胞(fAECIIs)的方法；以及维甲酸(RA)与介素24 (IL-24)对fAECIIs增殖及转分化的影响。方法：剖腹取孕19天胎鼠肺组织,运用胰酶、Ⅵ型胶原酶联合消化、差速离心、差速贴壁、IgG免疫粘附的方法分离、纯化得到fAECIIs。细胞培养24h、48h、72h、96h,倒置显微镜下观察细胞生长状况；血球细胞计数板计数细胞数目,描绘生长曲线；透射电镜观察细胞超微结构；免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察肺表面活性蛋白(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)的表达；实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表达。利用透射电镜及激光共聚焦免疫荧光法对细胞进行鉴定。鉴定好的细胞培养24h后,分别以RA、IL-24及IL-24中和抗体(Anti-IL-24)作为干预方式,干预作用24、48、72h后,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况和活力,倒置显微镜观察细胞生长状况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,RT-PCR检测SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表达,Western blot检测SP-C、AQP5蛋白的表达。结果：1、分离得到的胎鼠肺泡II型上皮细胞纯度为97.8+2.1%。细胞生长状况：细胞呈岛状分布生长,随着时间,细胞数目增多,体积增大,逐渐出现双核细胞及桥状连接,最终细胞出现空泡化走向凋亡。细胞数目：随时间细胞数增多,在72h细胞数最多,之后细胞数减少,各时间点差异有统计学意义(P0.01)。细胞超微结构：24h、48h细胞有AECII特征性的微绒毛和板层小体；72h细胞处于AECII和肺泡I型上皮细胞(AECI)之间的转分化中间状态细胞,细胞表面有微绒毛或细胞质内有板层小体；96h微绒毛和板层小体消失。免疫荧光：细胞质中SP-C绿色荧光在48h表达最强,随后逐渐减弱,细胞膜上点状分布的AQP5红色荧光随时间逐渐增强,72h可见两者共表达。SP-C mRNA、AQP5 mRNA的表达：SP-C mRNA在48h表达最强,随后逐渐减弱；AQP5 mRNA的表达量随时间逐渐增强。2、RA对fAECIIs的作用：细胞增殖和活力：RA作用24h对细胞增殖和活力无影响(P0.05)；而作用48h后,RA明显促进细胞增殖、增强细胞活力(P0.01),且促进作用在作用72h最显著(P0.05)。细胞生长状况：与对照组相比,RA使得细胞状态更佳,细胞贴壁更紧,折光性强,在作用72h效果最明显。细胞周期：RA作用24h对细胞周期无影响(P0.05),而作用48h、72h后,RA使细胞更多的处于G2期和S期(P0.01)。细胞凋亡：RA作用24h对细胞凋亡无影响(P0.05),而RA作用48h、72h后,早期凋亡与晚期凋亡细胞比例均显著低于对照组(P0.01)。SP-C mRNA、AQP5mRNA的表达：RA作用24h、72h后,SP-C mRNA的表达显著高于对照组(P0.01)；RA作用48h后,SP-C mRNA的表达显著低于对照组(P0.01)。在各时间点,RA均明显上调AQP5mRNA的表达(P0.01)。SP-C、AQP5蛋白的表达：RA作用24h、72h后,SP-C蛋白的表达显著高于对照组(P0.01)；RA作用48h后,SP-C蛋白的表达显著低于对照组(P0.01)。在各时间点,RA明显上调AQP5蛋白的表达(P0.05)。3、IL-24对fAECIIs的作用：差异表达：IL-24mRNA及IL-24蛋白的表达随时间延长均显著降低(P0.01)。细胞增殖和活力：IL-24促进细胞增殖(P0.01),促增殖作用在5 μ/gL最显著;Anti IL-24减慢细胞增殖(P0.01),抑制作用在20 μ g/L就可观察到。细胞生长状况：与对照组相比,IL-24使细胞贴壁紧,折光性增强,细胞伸展较少；Anti IL-24使细胞折光性减弱,细胞伸展更明显。细胞周期：IL-24导致细胞周期的G1减少,S期延长；Anti IL-24导致细胞周期G1期延长,S期明显减少。细胞凋亡：与对照组相比,IL-24组细胞早期凋亡与晚期凋亡比例显著降低(P0.01), Anti IL-24组细胞早期凋亡与晚期凋亡比例显著升高(P0.01)。SP-C mRNA, AQP5 mRNA的表达：IL-24上调SP-C mRNA的表达,下调AQP5 mRNA的表达；Anti IL-24上调AQP5 mRNA的表达,下调SP-C mRNA的表达。SP-C、AQP5蛋白的表达：IL-24上调SP-C蛋白的表达,下调AQP5蛋白的表达;Anti IL-24上调AQP5蛋白的表达,下调蛋白SP-C的表达。结论：1、胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶联合消化、差速离心、差速贴壁、IgG免疫粘附方法所得fAECIIs可用于后续研究；细胞早期(24h-48h)增殖活跃,后期(48h-72h)细胞增殖缓慢,开始转分化,96h后细胞走向凋亡。2、RA通过增强细胞活力、调节细胞周期、抑制细胞凋亡促进fAECIIs增殖,并促进SP-C和AQP5的表达,同时它可以促进fAECII向AECI转分化。3、IL-24通过增强细胞活力、调节细胞周期、抑制细胞凋亡促进fAECIIs增殖,同时它可以抑制fAECII向AECI转分化。
[Abstract]:Objective : To explore the methods of isolation , purification and culture of alveolar type II epithelial cells ( fAECES ) in primary fetal mice .
The effects of retinoic acid ( RA ) and interleukin - 24 ( IL - 24 ) on the proliferation and differentiation of fAECDC were studied . Methods : The cells were isolated and purified by trypsin and 鈪，

本文编号：1671777