氧化应激在LPS诱导小鼠肺巨噬细胞自噬中的作用机制

发布时间：2018-04-07 17:39

  本文选题：小鼠肺巨噬细胞　切入点：氧化应激　出处：《泸州医学院》2012年硕士论文

【摘要】：目的：目前国内外对氧化应激在脂多糖（Lippolysaccride,LPS）与自噬之间的相互作用及机制研究较少，本实验通过观察LPS诱导对小鼠肺巨噬细胞（Ana-1）损伤的影响，并从氧化应激Ana-1细胞DNA损伤和自噬角度研究氧化应激对LPS诱导对Ana-1细胞自噬的作用机制及其相关的分子机制。方法：1. LPS刺激Ana-1细胞模型的建立及氧化应激下LPS诱导Ana-1细胞损伤模型的建立。LPS作用于Ana-1细胞， ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞内活性氧族物质（ReactiveOxygen Species,ROS）的表达情况，总SOD活性检测试剂盒（WST法）检测Ana-1细胞总超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）的表达情况，彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况。氧化应激作用于LPS诱导下的Ana-1细胞，ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞ROS的表达情况，总SOD活性检测试剂盒（WST法）检测Ana-1细胞总SOD的表达情况，通过彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况，比较LPS作用于Ana-1细胞与氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞的指标变化情况。2.LPS作用下的Ana-1细胞自噬现象和氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞自噬现象。LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h（LPS处理组），逆转录聚合酶链反应（RT-PC R）法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化，脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3（green fluorescent protein-microtubule associated protein lightchain3，绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3）和质粒RFP-LC3（Redfluorescent protein-microtubule associated protein light chain3，红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3）观察LPS作用下的Ana-1细胞的自噬现象，免疫蛋白印记（Western Blot）法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达。氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞（LPS+H_2O_2处理组，，外源性H_2O_2浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后，再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h），RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化，脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3和质粒RFP-LC3观察自噬现象，Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。3.维生素C抗氧化应激损伤处理后(维生素C浓度为2000ug/ml,刺激1h后加入浓度为12.5uM的外源性H_2O_2，刺激Ana-1细胞2h后，再加入浓度为1ug/ml的LPS刺激Ana-1细胞4h)观察Ana-1细胞的自噬现象以及Western Blot法检测自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。4.对照组用PBS进行刺激。比较对照组、LPS处理组和LPS+H_2O_2处理组以及维生素C处理组两两间所测指标的变化和差异。结果：1. LPS作用于Ana-1细胞，与对照组相比较，细胞内ROS的表达浓度增高（P0.01）；总SOD的表达减少；彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤（P0.01）,提示LPS处理可诱导Ana-1细胞的氧化应激损伤。氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞内的ROS的表达浓度较LPS处理组明显增高，（P0.01）；总SOD的表达减少（P0.01）；彗星实验检测出Ana-1细胞DNA明显损伤（P0.01）。2.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H_2O_2处理组的ROS荧光强度和荧光数量发现：LPS处理组的ROS荧光强度和荧光数量与对照组相比较有所增加（P0.01）；LPS+H_2O_2处理组的ROS荧光强度和荧光数量较LPS处理组明显增加（P0.01）。3.RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化发现：LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多；LPS处理组较对照组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多。4.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H_2O_2处理组和维生素C处理组的GFP-LC3和RFP-LC3转染发现：LPS处理组较对照组的自噬小体有所增加；LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的自噬小体在胞质内表达明显增加；维生素C处理组较LPS+H_2O_2处理组的自噬小体有所减少。5.Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白表达发现：LPS处理组较对照组的BECN1表达水平量增多（P0.01）；LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的BECN1表达水平量增多（P0.01）。Western Blot法检测自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白发现：LPS处理组较对照组的LC3表达水平量增多（P0.01）；LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的LC3表达水平量增多（P0.01）；维生素C处理组较LPS+H_2O_2处理组的LC3表达水平量减少（P0.01）。结论：1.LPS可诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激，导致细胞损伤。氧化应激下LPS诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激加强，加重细胞的DNA损伤。2.氧化应激下LPS诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬加强,上调自噬相关蛋白BECN1和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达，这与氧化应激造成细胞DNA损伤有关。3.通过抗氧化剂维生素C处理发现，维生素C能降低氧化应激下LPS诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的GFP-LC3和RFP-LC3的转染表达以及自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白，再次证明氧化应激加强LPS诱导下小鼠肺巨噬细胞Ana-1的细胞损伤，从而加重细胞自噬现象。
[Abstract]:AIM : To investigate the interaction and mechanism of oxidative stress between lipopolysaccharide ( LPS ) and autophagy at home and abroad . The mechanism and molecular mechanism of oxidative stress on the autophagy of Ana - 1 cells induced by LPS from oxidative stress Ana - 1 cell DNA damage and autophagy were studied . The effects of LPS on the expression of total superoxide dismutase ( SOD ) in Ana - 1 cells were detected by MTT assay . The expression of total superoxide dismutase ( SOD ) in Ana - 1 cells was detected by MTT assay . Compared with the control group , the concentration of ROS in the cells was higher than that of the control group ( P0.01 ) .
the expression of total SOD decreased ;
The DNA of Ana - 1 cells was damaged by comet assay ( P0.01 ) . It was suggested that LPS treatment could induce oxidative stress injury in Ana - 1 cells . The expression of ROS in Ana - 1 cells induced by LPS was significantly higher than that in LPS - treated group ( P0.01 ) .
The expression of total SOD was decreased ( P0.01 ) .
The content of ROS fluorescence intensity and fluorescence in LPS treated group , LPS treated group , LPS + H _ 2O _ 2 treatment group were compared with that of control group ( P0.01 ) .
The levels of ROS fluorescence intensity and fluorescence in LPS + H _ 2O _ 2 treatment group were significantly higher than those in LPS - treated group ( P0.01 ) .
The expression of LC3 - 鈪

本文编号：1720184