磷酸肌醇3-激酶信号通路参与肺损伤修复及机制探讨

发布时间：2018-04-27 02:19

  本文选题：磷酸肌醇3-激酶 + 急性肺损伤　； 参考：《复旦大学》2012年博士论文

【摘要】：第一部分PI3K抑制剂对急性肺损伤的保护作用及机制 目的：探讨磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinases, PI3K)抑制剂对肉毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所致小鼠急性肺损伤的保护作用,并比较不同的给药方式、给药剂量、药物种类以及不同时间点的疗效差别。 方法：取6-8周龄的雄性CD-1小鼠,连续3天分别经鼻(0.5mg/kg)或经胃管(50mg/kg)滴入3种不同的P13K抑制齐(?)(LY294002,SHBM009,GDC0941)或PBS,随后经气道滴入LPS(1.25mg/kg)诱导肺损伤,分别在LPS滴入后4h和24h处死小鼠(每组每个时间点10只)。观察这3种P13K抑制剂对LPS刺激后小鼠肺毛细血管通透性、肺组织重量/体重比值、肺组织气体容量(excised lung gas volume, ELGV)、肺泡灌洗液蛋白渗出和炎症细胞浸润、肺泡灌洗液(Brochoalveolar lavage fluid,BALF)炎症因子水平的影响,并比较不同给药方式、不同时间点的疗效差别。A549上皮细胞分别在含有不同浓度SHBM1009(1或10ug/mL)的培养基中培养,然后用LPS(1ug/ml)或PBS刺激。在刺激后3,6,12,24收集培养液上清,4℃离心10000rpm10min,用ELISA方法测定培养液上清中角质细胞源性趋化因子(KC)、白三烯B4(LTB4)的水平。 结果：LPS刺激后4h和24h小鼠肺组织重量/体重的比值明显高于PBS刺激组(P0.01),经鼻或经胃管滴入LY294002或GDC-0941能抑制肺组织重量/体重比值的升高(P0.05),具有保护作用。经鼻滴入SHBM1009亦具有明显保护作用(P0.01)。经鼻滴入LY294002或SHBM1009能明显抑制LPS刺激4h或24h后ELGV的增加(P0.05)。经鼻滴入这3种P13K抑制剂均能抑制LPS刺激后4h肺泡灌洗液的白细胞浸润(P0.01或0.05)。LPS刺激能明显增加4h和24h小鼠肺泡灌洗液角质细胞趋化因子(KC)的含量(P0.01),只有SHBM1009经鼻滴入4h组显示出明显抑制作用(P0.01)。利用伊文思蓝染色证明LPS能增加肺泡毛细血管通透性(P0.01),而经鼻滴入SHBM1009具有明显保护作用(P0.05)。通过肺组织免疫荧光染色方法发现经鼻滴入SHBM1009能抑制LPS所诱导的中性粒细胞(P0.01)和巨噬细胞的浸润(P0.05)。经LPS刺激的气道上皮细胞培养液上清中KC的水平在3-24h均有明显升高,而SHBM1009(1ug/ml和10ug/ml)能显著抑制上皮细胞分泌KC,且呈剂量依赖性(P值分别为P0.05和P0.01)。LPS刺激后24h,上清液中LTB4和LTB4的水平也有明显升高。 结论：P13K抑制剂能预防LPS所导致的小鼠急性肺损伤,主要通过保护毛细血管内皮屏障、抑制上皮细胞活化、抑制炎症细胞浸润和黏附能力、减少炎症因子释放等。局部给药的保护作用优于全身给药,且不同P13K抑制剂的保护作用也有差异,这可能和药物的化学结构、靶向部位以及药动学特点有关。 第二部分PI3K抑制剂对慢性气道炎症、组织损伤和气道重塑的治疗作用 目的：探讨P13K抑制剂对胰弹性蛋白酶(pancreatic elastase,PE)所诱导的大鼠慢性气道炎症、组织损伤和气道重塑的治疗作用。 方法：取180-200g的健康雄性Wistar大鼠,气道滴入PE(250IU/kg)诱导肺损伤模型,在随后的7天或28天内经鼻滴入PBS、SHBM1009或布地奈德(budesonide, Bud)观察其治疗作用。实验共分为6组：1)Sham组：PBS刺激+PBS治疗；2) Vehicle组：PE刺激+PBS治疗；3) SHBM1009对照组：PBS刺激+SHBM1009(10mg/kg);4) SHBM1009(?)(?)剂量组：PE刺激+SHBM1009(1mg/kg);5)SHBM1009高剂量组：PE刺激+SHBM1009(10mg/kg);6) Bud组：PE刺激+Bud (10mg/kg)。每组每个时间点6只大鼠。通过HE染色、电镜、Masson染色观察大鼠肺组织病理变化,同时测定大鼠ELGV、肺组织密度、肺组织重量/体重、BALF蛋白含量和细胞计数,ELISA方法检测肺泡灌洗液炎症因子IL-1β水平,RT-PCR方法检测肺组织Fibulin-5的表达。体外实验部分,A549细胞以合适密度接种于24孔培养板,以不同浓度PE(0.03U/ml,0.3U/ml,1U/ml,2U/m1)或Vehicle刺激与不同浓度的SHBM1009(0.01umol/L,0.1umol/L,1umol/L,10umol/L)或BEZ235(0.01umol/L,0.1umol/L,1umol/L,10umol/L)共培养,Cell-IQ细胞实时监测系统观察48h内细胞增生、分裂和凋亡情况。 结果：组织病理学HE染色可见PE刺激后28天,肺泡壁断裂,肺泡腔明显扩大,电镜观察可发现肺泡II型上皮细胞微结构变化、间质胶原沉积及成纤维细胞增生、气血屏障破坏,Masson染色可见Vehicle治疗组胶原含量明显增多,而SHBM1009或Bud治疗能保护肺组织结构的破坏。Vehicle治疗组在7天和28天肺组织重量和ELGV值较Sham组和SHBM1009对照组明显升高(分别为P0.05和P0.01)。PE刺激能诱导肺组织重量增加,虽SHBM1009(1mg/kg)和Bud (10mg/kg)治疗组在第7天和28天肺组织重量较vehicle治疗组明显减轻,但与Sham组相比仍有明显升高(P0.05or0.01)。在PE刺激后第7天,大鼠肺组织密度明显升高,第28天时,肺组织密度明显减轻,SHBM1009或Bud治疗具有明显保护作用(P0.01)。PE刺激后第7天,Vehicle组肺泡灌洗液蛋白含量明显增加(P0.01),SHBM1009或Bud治疗均具有明显抑制作用(P0.05orP0.01)。PE刺激后第7天和第28天,BALF细胞计数明显增多(P0.01),SHBM1009或Bud治疗均具有明显抑制作用(P0.05or0.01)。PE刺激能诱导BALF炎症因子IL-1p水平的升高,SHBM1009或Bud治疗均具有明显抑制作用(P0.05or0.01)。Fibulin-5mRNA的水平在Vehicle组明显升高,SHBM10091mg/kg或10mg/kg治疗组在第28天均显示出治疗作用,Bud治疗组在第7天和28天均显示出治疗作用。PE刺激能明显抑制气道上皮细胞的增生和分裂,且呈剂量和时间依赖效应,而对细胞凋亡的影响较小。当PE浓度为1U/ml时,BEZ235在浓度0.1-1.0uM或SHBM1009在浓度0.01-10uM具有明显保护作用。而当PE浓度为0.3U/ml时,BEZ2350.01或0.1uM/ml或SHBM10090.01-1.0uM时保护作用较明显。 结论：P13K参与了肺损伤的发生和发展过程,包括早期的炎症反应、肺水肿,以及后期的组织修复、气道重塑和肺气肿,其机制主要通过促进上皮细胞的增生分裂,修复损伤的上皮,并能抑制成纤维母细胞增生和胶原沉积,从而减轻气道重塑。P13K抑制剂可能成为慢性气道疾病的一个治疗的新靶点。 第三部分KGF-2对大鼠原位肺缺血再灌注损伤的保护作用及机制 目的：探讨角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)对大鼠原位肺缺血再灌注损伤的保护作用,及对内皮细胞屏障功能的影响。 方法：健康雄性SD大鼠250g左右,分成6组,每组15只,分组如下:1)Sham组：手术开胸但不经历缺血-再灌注；3)缺血再灌注(ischemia-reperfusion, IR)组(I/R)：动物经开胸后,左肺门夹闭60min,再灌注180min；3),4)和5)KGF-2低、中、高剂量治疗组：动物在手术前72h气道滴入KGF-22.5mg/kg,5mg/kg和10mg/kg,之后行缺血再灌注手术；6)地塞米松(dexamethasone, DXM)组：在缺血再灌注手术前2h腹腔注射地塞米松5mg/kg。在缺血再灌注损伤前后分别采集血标本行血气分析,动物处死后HE染色行肺组织形态学测量,计算肺湿干重比值,收集肺泡灌洗液进行细胞计数和蛋白水平检测,肺组织提取RNA和蛋白进行后续分子生物学分析。体外培养人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cell, HPMEC)进一步探讨KGF-2对内皮细胞保护作用的机制。Cell-IQ. Brdu细胞增殖实验检测KGF-2对细胞增殖和凋亡的影响；FITC标记白蛋白的通透性及跨膜电阻抗检测内皮细胞屏障功能。 结果：肺组织形态学观察显示IR组肺组织出血、水肿和炎症反应明显较Sham组严重,KGF-2和DXM均具有预防作用,其中KGF-22.5mg/kg和5mg/kg的保护作用最明显(P0.01)。IR组肺组织湿/干重比值明显增大,KGF-22.5mg/kg,5mg/kg和DXM5mg/kg具有保护作用(P0.05)。缺血再灌注之前,所有组血氧分压无明显差别,IR之后,IR组、KGF-210mg/kg组及DXM组血氧分压均明显降低(P0.05),而KGF-22.5mg/kg和5mg/kg预处理显示出明显保护作用(P0.05)。IR之后,大鼠肺泡灌洗液细胞计数和蛋白水平均明显增加,KGF-2和DXM均显示出不同程度的保护作用(P0.05或P0.01)。RT-PCR检测显示KGF-2能促进肺泡表面蛋白C (surfactant protein C, SPC)的表达,而对SPA的表达量无明显影响。体外实验发现,在无损伤刺激的情况下,KGF-2不促进内皮细胞的过度增殖,但可维持损伤情况下细胞总数的稳定增长。此外,KGF-2还可保护内皮细胞的正常屏障功能。 结论：KGF-2预处理能保护缺血再灌注所致肺损伤,减轻炎症反应、水肿和出血。其保护作用机制可能包括促进肺泡表面活性物质的表达、维持气血屏障的正常结构和功能。
[Abstract]:The protective effect and mechanism of the first part of PI3 inhibitor on acute lung injury

Objective : To investigate the protective effects of phosphoinositide 3 - kinase inhibitor on acute lung injury in mice induced by lipopolysaccharide ( LPS ) .

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本文编号：1808739