2致肺泡巨噬细胞自噬对其分泌相关因子的影响

发布时间：2016-11-25 20:39

  本文关键词：SiO_2致肺泡巨噬细胞自噬对其分泌相关因子的影响，由笔耕文化传播整理发布。

《华北理工大学》 2015年

SiO_2致肺泡巨噬细胞自噬对其分泌相关因子的影响

朱会兴  

【摘要】：目的采用体外培养细胞的方法,使用Si O2体外刺激染尘法制备细胞损伤模型。探讨:1自噬抑制剂3-MA(3-methyl adenine,3-MA)对肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages,AM)自噬的调控及其释放炎性因子的影响;2 AM上清液对肺成纤维细胞(Fibroblast,FB)所产生的影响。方法1模型制备及分组:应用肺灌洗法收集AM,体外暴露AM染尘的方法制作模型,在染尘成功12 h后,给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预(10mmol/L)。取10只胎鼠用于FB分离及培养,并使用各组的AM上清液分别对FB进行干预刺激。并于干预后6 h、18 h、24 h、36 h用胰酶消化,收集体外培养的细胞。分组:将30只雄性SPF级SD大鼠(体重190~220g)肺灌洗出的AM随机方法分成三组:AM组(对照组)、AM+Si O2组(Si O2组)、AM+Si O2+3-MA组(3-MA组);用各组的AM上清液刺激分别为,AM上清+FB组(对照干预组),AM上清+Si O2+FB组(Si O2+FB组),AM上清+Si O2+3-MA+FB组(3-MA干预组)。2检测指标及方法:○1一般形态学观察:使用HE染色的方法检测AM形态学改变;○2免疫细胞化学染色法检测LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β的表达及分布;○3免疫印迹法检测LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β,I、III型胶原的蛋白表达量。3统计学分析:使用免疫细胞化学法检测细胞阳性度,并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析,用积分光密度值(IOD值)表示。蛋白定量使用Image J图像分析处理软件对蛋白所反应的条带进行半定量分析,得到光密度值(OD值),以目的蛋白的OD值比内参(β-actin)OD值的比值,做为基础对照进行对比。在本实验中获取的实验数据结果使用Excel建立,用均值±标准差(`x±s)体现,使用SPSS 16.0系统将所得数据随机的单因素方差分析,两组间的比较采用qq检验的方式,用P0.05表示差异具有统计学意义。结果1 AM的形态学检测结果:HE染色结果显示,对照组中AM呈现出圆形或椭圆形,细胞结构较清晰,形态均一,并没有发现矽尘颗粒。同对照组相比较,模型组AM的体积出现明显变大,多为不规则形状,细胞核为嗜碱性染色,细胞核大多居于细胞的中间部位或靠近边缘,细胞胞质相对较丰富,有些AM的细胞胞浆内可发现矽尘颗粒。2免疫细胞化学染色检测结果:LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β均为胞浆表达,对照组LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β仅有微弱表达,呈现淡棕黄色。与对照组相比,矽肺模型组在各时间点的阳性表达均增强,免疫反应性较强,并且其表达变化趋势,伴随时间的增加,其表达强度也相应增加,到达第18 h时达到高峰(P0.05)。与矽肺模型组相比,3-MA组在相对应的各时间点的表达都发生减弱,但整体表达趋势未发生改变。3免疫细胞印迹检测结果:对照组中LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β的蛋白表达仅显示出少量的基本结果,并且在各个时间点的表达都没有显著变化。同对照组进行比较得出,矽肺模型组LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β各蛋白的表达都出现了显著的增长趋势(P0.05)。并且表达情况为动态变化趋势,从6 h时开始出现上升,持续增长到第18 h到达增长高峰,24 h和36 h时表达出现下降,相对于对照组同时间的表达水平仍有明显的增高。对比模型组,3-MA组中的LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β各蛋白在每个时问点的表达都出现了明显的下降,变化趋势没发生改变,表达高峰仍然出现在第18 h(P0.05)。在对照干预组中I、III型胶原蛋白仅有少量的基础表达,并且每个时间点的表达并没有发生明显变化趋势改变。相对于对照干预组相,模型干预组中I、III型胶原的蛋白表达在各时间点都有明显的增高(P0.05),并且蛋白的表达呈现动态变化趋势,从6 h时即开始增高,随时间变化蛋白的表达也持续升高,到36 h时蛋白的表达水平达到增长的高峰(P0.05)。相对于模型干预组,3-MA上清组I、III型胶原蛋白的表达在相对应的时间点都出现明显下降趋势(P0.05),蛋白的整体表达变化趋势没有发生改变。结论在大鼠矽肺的发生发展过程中抑制了自噬的发生后,可以下调AM中相关因子的表达及释放,进而促进炎症损伤的修复。AM上清干预组减少FB中纤维化因子的释放,进而缓解矽肺病的加重。

【关键词】：
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R135.2
【目录】：

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