气道剪应力作用下黏蛋白5AC胞外极向分泌的主要介导机制研究

发布时间：2018-05-26 11:52

  本文选题：气道剪应力 + 黏蛋白5AC　； 参考：《重庆医科大学》2013年硕士论文

【摘要】：目的：探讨气道剪应力（SS）作用下黏蛋白（MUC）5AC胞外极向分泌的主要介导机制。 方法： (1)采用Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表达载体转染Cortactin-siRNA抑制Cortactin功能，并用Western印迹法检测目标序列组与对照序列组的Cortactin水平，确认转染成功后进行后续实验。 (2)采用节律性旋转装置模拟呼吸时气流介导的SS。该装置旋转过程中通过加速/减速交替进行的方式模拟呼吸过程中吸气/呼气对气道的牵拉作用即为剪应力。为模拟病理状态下气流对气道上皮细胞的SS作用，，我们把加速/减速的时间设置为1.2s/次，30次/min。每组作用30min。 (3)人支气管上皮细胞(16HBE)以5×105个细胞/孔接种在6孔硅胶培养皿上并置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长融合至70%左右，使用Stata软件产生随机数组随机分为5组：A组(空白对照组)；B组(SS组)；C组(SS+Rac-1特异性抑制剂组）；D组(SS+F-actin解聚剂组)；E组（SS+Cortactin-siRNA转染组）；每组各设6个复孔。置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养2h后进行相关检测。上述实验重复3次用于统计学分析。 (4)分别采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中MUC5AC的胞外相对分泌量； Western印迹法检测Cortactin及p-Cortactin的相对水平和转染效果；激光共聚焦显微镜观察F-actin聚合情况。 结果： (1)通过Western印迹法检测目标序列组与对照序列组的Cortactin相对表达水平后确认Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表达载体转染成功，可用于后续实验。 (2) ELISA法检测各组细胞上清液中MUC5AC水平：与A组（0.210±0.013）相比，B组（0.631±0.025）MUC5AC胞外相对分泌水平显著增加（P=0.000）；与B组相比，C组、D组和E组（0.473±0.112、0.330±0.067、0.272±0.019）MUC5AC胞外相对分泌水平均明显降低（P=0.043、0.000、0.000）。 (3) Western印迹法检测Cortactin及p-Cortactin的相对水平：B组Cortactin相对表达水平为（0.670±0.048），显著高于E组的（0.132±0.014）（P＜0.01），但与A、C、D组的（0.641±0.016、0.622±0.012、0.653±0.027）比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；B组p-Cortactin相对表达水平为（0.582±0.067），显著高于A、C、E组的（0.131±0.011、0.393±0.045、0.170±0.016）（P=0.000、0.021、0.000），而D组（0.511±0.029）与B组差异无统计学意义（P=0.246）。 (4)激光共聚焦显微镜观察F-actin聚合情况：A组几乎没有聚合状态的F-actin，表现为无丝状荧光出现；B组F-actin聚合程度高，呈平行排列、粗细均匀、长短一致的丝状荧光；C组F-actin聚合程度较B组略有减弱，丝状荧光的平行排列稍显紊乱、粗细稍欠均匀、长短不一致；D组F-actin聚合程度显著降低，丝状荧光排列紊乱，无细长的丝状荧光；E组F-actin聚合程度明显降低，丝状荧光长短不一、粗细不均、排列紊乱。 结论： 在气道SS作用下，通过激活Rac-1、Cortactin和F-actin而促进MUC5AC胞外极向分泌，产生黏液高分泌的病理状态。Rac-1、Cortactin和F-actin是SS作用下MUC5AC胞外极向分泌的主要介导分子。
[Abstract]:Aim: to investigate the mediating mechanism of extracellular polar secretion of MUC5 AC under the action of airway shear stress (SSSS). Methods: 1) Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo expression vector was used to transfect Cortactin-siRNA to inhibit the function of Cortactin. The level of Cortactin in target sequence group and control sequence group was detected by Western blotting, and the subsequent experiment was carried out after the transfection was successful. A rhythmic rotating device was used to simulate the airflow mediated SSs during respiration. In the process of rotation, shear stress is simulated by alternate acceleration and deceleration in the process of breathing, in which the pulling effect of inspiratory and exhalation on the airway is simulated. In order to simulate the SS effect of airflow on airway epithelial cells in pathological state, we set the acceleration / deceleration time to 30 1.2s/ min. Each group acted for 30 minutes. 3) Human bronchial epithelial cells were inoculated with 5 脳 10 5 cells / well on 6 well silica plates and cultured in 37 鈩

本文编号：1937140