慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响

发布时间：2016-12-02 19:16

  本文关键词：慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响，由笔耕文化传播整理发布。

《第三军医大学》 2012年

慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响

欧娜  

【摘要】：【背景和目的】 阻塞型睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是呼吸科的常见病、多发病，其特点为睡眠期间反复发生上气道阻塞并引起呼吸暂停。表现为口鼻腔气流停止而胸腹呼吸动作尚存在。是一种累及多系统并造成多器官损害的睡眠呼吸疾病。有人提出假说，认为OSAHS主要由于上呼吸道横纹肌适应性下降，在非清醒状态下(如睡眠)不能保持呼吸道的开放。目前认为舌根松弛、肥厚或者舌体肥厚导致睡眠期间舌后坠是OSAHS的常见病因之一。颏舌肌是最重要的上气道扩张肌，，其正常收缩使舌体前移，阻止咽腔缩小并对抗气流阻力，维持气道通畅。据临床和基础研究证实，颏舌肌功能异常可导致上气道陷闭，并且是引发OSAHS的最主要原因之一，因此，改善颏舌肌功能是有效、合理治疗OSAHS的关键所在。 骨骼肌可塑性强，多种外界刺激可致其肌纤维构成及其功能发生转变已是不争的事实，而模仿通常用来支配慢收缩肌的神经冲动方式发展而来的慢性低频电刺激(Chronic low frequency electrical stimulation, CLFS)就是有效手段之一，我们前期的研究发现在慢性电刺激后，低压缺氧兔颏舌肌的肌球蛋白重链(myosin heavychain,MHC)“由快向慢”转变(MHC由II型向I型转变)，这种转变在低频复合生理频率的电刺激时变化趋势非常显著。我们进一步的研究表明，CESLPF诱导慢性低压缺氧兔颏舌肌肌球蛋白重链由MHC IIb型向MHC IIa和MHC I型转变，内质网(SR) Ca~(2+)的摄取-释放功能显著增强，这种变化在超低频复合生理频率刺激组的变化更加显著。目前变频电刺激引起的骨骼肌的肌纤维类型转变机制尚不明确。钙调神经磷酸酶(CaN)和Ca~(2+)/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)在骨骼肌肌纤维类型转变通路中起重要作用，但慢性变频电刺激所致MHC肌型转换是否与此有关尚未见详细报道。 因此，本研究以小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞成肌分化为模型，研究CaN在MHC类型重构中的作用，探讨慢性变频电刺激应用于临床治疗OSAHS的可能机制。 【研究方法】 一、建立C2C12细胞成肌分化模型 1.成肌细胞C2C12细胞系在含10%胎牛血清的DMEM增殖培养液(growthmedium, GM)中扩增培养； 2.待C2C12细胞生长至70%～80%融合时，改用含2%马血清的DMEM分化培养液(differentiation medium, DM)诱导C2C12细胞分化。细胞培养于37℃，5%CO2，饱和湿度细胞培养箱中。 二、C2C12肌球蛋白重链MHC各亚型肌纤维比例的鉴定 C2C12肌细胞模型构建成功后，采用请PCR和Western-blot分别检测C2C12细胞MHC亚型的mRNA和蛋白的表达。 三、体外低频复合生理频率模型的建立 我们采用自制变频电刺激仪建立体外低频复合生理频率模型，将经马血清诱导分化的C2C12成肌细胞分为3组，分别为分化对照组、KN93(6μMol)组和CsA(8μMol)组，电刺激的频率采用(10+40Hz)进行刺激，每天刺激1.5h，共刺激2天。 四、低频及低频复合生理频率对C2C12MHC亚型表达的影响 1.采用半定量反转录聚合酶链反应(Reverse ranscription-polymerase chainreaction，RT-PCR)分析各组C2C12MHC各亚型mRNA表达的变化 2.采用Western印迹法分析各组兔颏舌肌MHC各亚型蛋白表达的变化 五、钙调神经磷酸酶活性的检测 对钙调神经磷酸酶活性的检测采用比色法进行。检测方法按照CaN活性比色法定量检测试剂盒说明书进行。 【研究结果】 1.成肌细胞C2C12经过诱导分化后出现肌管，细胞分化好，说明我们建立的成肌分化模型成功。 2.RT-PCR和Western-blot检测结果显示：分化对照组MHCⅠ型和MHCⅡ型均有表达，KN93及CSA组MHCⅠ型明显被抑制。 3. RT-PCR检测结果显示，低频及低频复合生理频率电刺激后,10Hz电刺激时，CsA组和KN93组细胞MHC I的mRNA表达均有显著降低(P0.05)，以CsA组MHCI的表达降低最为明显；当采用复合生理频率刺激时，CsA和KN93对MHC I表达的抑制作用被完全逆转，与正常对照组相比无显著差异(P0.05) 4.Western-blot检测结果显示：抑制剂KN93和CsA处理后，MHC I的表达显著降低，MHC IIb显著增加；CsA组经低频复合生理频率电刺激可以抑制MHC IIb的表达，但对MHC I的提升不明显，该结果与PCR检测结果一致。 5. CsA可以显著抑制CaN的酶活性。在C2C12细胞经复合生理频率刺激后，CaN的活性有所提高，但仍低于对照组(P0.05)。 【全文结论】 1.成肌细胞C2C12可以分化成肌管,是体外研究骨骼肌成肌细胞增殖、分化和功能理想的研究模型； 2.KN93及CsA两种抑制剂可以抑制MHCI型的表达,这种现象对以后研究成肌细胞的分化及转型是有帮助的； 3.低频复合生理频率电刺激可以逆转CsA及KN93对MHCI型的抑制作用。这种变化可能缘于慢性电刺激所致的肌纤维类型转变及其相应MHC亚型合成改变； 4.低频复合生理频率电刺激能够部分逆转CsA抑制CaN活性之后导致的C2C12骨骼肌细胞内肌球蛋白的类型改变，同时CESLPF还能增强C2C12肌细胞内CaN的活性； 5.低频复合生理频率慢性电刺激有望成为一种针对OSAHS的新的治疗手段，但在临床上的具体应用还有待进一步研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R56
【目录】：

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