肺泡巨噬细胞在过敏性哮喘中发挥作用的初步研究

  本文关键词：肺泡巨噬细胞在过敏性哮喘中发挥作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

《泰山医学院》 2014年

肺泡巨噬细胞在过敏性哮喘中发挥作用的初步研究

黄华  

【摘要】：目的 以鸡卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）与免疫佐剂明矾（Aluminium hydroxide,ALUM）来腹腔致敏小鼠，并联合OVA雾化诱导小鼠过敏性哮喘，研究肺脏中肺泡巨噬细胞(AM)在过敏性哮喘中发挥的作用。 以C57BL/6小鼠及相关转基因和基因敲除小鼠为实验动物，建立小鼠哮喘模型，，主要以CD11c-DTR转基因的嵌合小鼠气管内注射白喉毒素（Diphtheria toxin，DT）清除肺脏中的肺泡巨噬细胞（AM）与树突状细胞亚群(DCs)，来研究肺脏中肺泡巨噬细胞在过敏性哮喘中的作用机制。本论文目前主要以细胞与分子免疫学、免疫荧光及免疫组织化学方法为核心技术，研究在过敏性哮喘发生发展过程中，天然免疫水平上肺中AM与DCs的变化，以及肺脏中AM与DCs对获得性免疫反应的调节性功能的变化，以明确其可能的作用机制。为探索过敏性哮喘等呼吸系统相关疾病的发病机制、研制预防、治疗过敏的药物及方法提供理论依据。 方法 首先，选用雌性6-8周的C57BL/6小鼠，以免疫佐剂明矾（alum）混加入鸡卵清蛋白（OVA），震荡混匀充分乳化OVA后，对小鼠腹腔注射做初次致敏免疫，14天后再次相同剂量进行第二次致敏免疫。在第二次腹腔致敏后，用OVA在28-30连续雾化3天，每次30min，建立小鼠过敏性哮喘模型。 其次，联合应用相关转基因和基因敲除纯合小鼠及其嵌合小鼠建立哮喘模型。对CD11c-DTR转基因小鼠颈椎脱臼处死，取其骨髓制单细胞悬液，尾静脉回输到辐照后的相应小鼠，制造CD11c-DTR嵌合鼠，并且8周后检测嵌合情况，建立CD11c-DTR嵌合小鼠过敏性哮喘模型。 最后，各组小鼠最后一次雾化24小时后，摘眼球取血，颈椎脱臼处死，取支气管肺泡灌洗液、肺脏、肺引流淋巴结、脾脏等；以ELISA的方法检测血清和灌洗液中IL4、IgG1、IgG2b等的表达水平；以Real-time PCR检测肺组织及其引流淋巴结中细胞因子和转录因子的表达水平；以FACS Aria II的含9色流式细胞仪检测相关的树突状细胞亚群（DCs）、肺泡巨噬细胞(AM)、淋巴细胞亚群及其相关的胞内细胞因子的表达水平；对肺部组织切片进行HE、PAS，观察肺部组织形态、肺部变应性炎症反应状态的变化情况。 结果 C57BL/6小鼠哮喘模型，流式细胞仪检测发现支气管肺灌洗液以及肺部单细胞悬液的嗜酸性粒细胞数所占比例，OVA+ALUM组＞PBS组。AM、DC所占比例，均呈OVA+ALUM组＞PBS组。肺部切片HE/PAS染色，OVA+ALUM组较PBS组肺部呼吸道周围炎症细胞募集浸润程度以及气道粘液分泌程度要严重。ELISA检测血清发现IgG1的表达OVA+ALUM组＞PBS组，而IgG2b无差异。从而证明OVA+ALUM腹腔致敏并且OVA雾化组肺部炎症状态较为严重，明显高于PBS阴性对照组。CD103+CD11b-DCs在过敏原激发后的肺部会大量募集，且CD4+T大量增殖。 CD11c-DTR转基因嵌合小鼠气管内注射白喉毒素（DT）效果相对稳定，注射DT后，主要清除CD103+DC亚群和肺泡巨噬细胞。进一步研究DC和肺泡巨噬细胞清除后的回归规律发现DC比AM早约4天回归。 CD11c-DTR转基因嵌合小鼠哮喘模型，气管内注射DT组，流式细胞仪检测发现支气管肺灌洗液以及肺部单细胞悬液的嗜酸性粒细胞数所占比例较OVA+ALUM组明显下降，肺部切片HE/PAS染色，较OVA+ALUM组呼吸道周围炎症细胞募集浸润程度以及气道粘液分泌程度明显减轻，从而证明DT组肺脏内在清除AM以及DC后会导致肺部炎症明显下降，CD4+T增殖明显降低；而在肺泡巨噬细胞被大量清除，DC已经完全回归的情况下，肺部虽存在炎症，但较OVA+ALUM组相对较轻。 结论 1、明确了肺部树突状细胞与肺泡巨噬细胞的分析策略，成功建立哮喘小鼠模型； 2、CD103+DCs与过敏性哮喘肺部炎症过程中的TH2分化相关； 3、DT清除肺部树突状细胞与肺泡巨噬细胞后，DC早AM约4天回归； 4、肺泡巨噬细胞在过敏性哮喘的肺部炎症过程中有促进炎症作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：泰山医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25
【目录】：

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