TLR4与核仁素受体在呼吸道合胞病毒感染中枢神经元所致损伤中的介导作用

发布时间：2016-12-13 09:33

  本文关键词：TLR4与核仁素受体在呼吸道合胞病毒感染中枢神经元所致损伤中的介导作用，由笔耕文化传播整理发布。

《安徽医科大学》 2015年

TLR4与核仁素受体在呼吸道合胞病毒感染中枢神经元所致损伤中的介导作用

吴璇  

【摘要】：目的探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染中枢神经元细胞(neuron2a.N2a),细胞膜上的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核仁素受体(Nucleolin,NCL或C23)的变化情况,研究TLR4和核仁素受体在RSV感染中枢神经系统所致损伤中的介导作用,为临床RSV感染中枢神经系统的预防和治疗提供新的思路。方法以RSV感染体外培养的N2a细胞,并通过siRNA沉默TLR4、核仁素受体表达,分别于感染后1、2、4、12、24和48 h不同时间点收集细胞和培养上清液。(1)激光共聚焦显微镜检测TLR4、核仁素受体与RSV F蛋白结合情况,以及神经核蛋白(NeuN)在N2a细胞中阳性细胞数目的表达变化；(2)用TRIzol法提取N2a细胞总RNA,通过实时荧光定量PCR法检沏TLR4、C23 mRNA 转录水平变化；(3)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点TLR3、TLR4、TLR7.C23以及NF-κB蛋白水平的表达变化；(4)流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；(5)空斑形成实验(plaque forming unit,PFU)检测各组细胞培养上清液中病毒增殖的滴度；(6)酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子的表达。结果(1)激光共聚焦显微镜检测结果显示,TLR4和C23受体在N2a细胞膜表面可以结合RSV F蛋白,在RSV感染1、2和4 h的入胞过程中,随着感染时间点的延长,F蛋白与TLR4和C23的结合逐渐增加；TLR4被干扰后,RSV F蛋白标记的蓝色荧光表达强度较RSV感染组和C23 siRNA组降低,表明TLR4与F蛋白结合减少,RSV在N2a细胞内增殖能力减弱；C23受体沉默后,核仁素受体与F蛋白结合减少,但可见TLR4结合更多F蛋白,提示TLR4可结合更多的RSV进入N2a细胞增殖；RSV感染组中N2a细胞中NeuN标记的阳性细胞数目较TLR4siRNA、C23 siRNA组的阳性细胞数目明显降低。(2)在mRNA转录水平,TLR4和C23在感染1-4 h的入胞过程表达量逐渐增高,4 h后表达量降低,说明TLR4和C23在细胞膜上识别RSV入胞过程中具有重要的作用；在瞬时转染TLR4 siRNA后,TLR4和C23蛋白的表达虽有上调,但表达量都比RSV感染组同时间点明显下降,且下降有统计学意义；在加入C23siRNA后,TLR4和C23 mRNA表达比RSV感染组同一时间点的表达量降低。(3) Western b lot法测定结果显示,正常对照组中TLR4和C23蛋白表达量较低,在RSV感染组,TLR4和C23蛋白在感染的1、2和4 h表达水平开始增强,4 h达到最高表达量,4 h后开始下降,至感染的48 h时,TLR4和C23蛋白表达水平较正常对照组一直处于增强状态；在TLR4或C23 siRNA组,TLR4和C23蛋白表达虽有上调,但表达量都比RSV感染组同时间点明显下降,且具有统计学意义。RSV感染组中TLR3/TLR7/NF-KB蛋白表达升高具有时间依赖性；在C23siRNA组,TLR3/TLR7/NF-KB蛋白的表达量虽有上调,仍比RSV感染组同时间点降低；在给予TLR4 siRNA处理后,TLR3/TLR7/NF-KB与RSV感染组和C23siRNA组同时间点相比降低的更明显,具有显著统计学意义；通过阻断TLR4或C23受体的表达,可以降低TLR3/TLR7/NF-KB在RSV感染N2a细胞过程中的活化过程。(4)流式细胞术结果显示,RSV感染N2a细胞48 h,可见细胞出现早期凋亡与晚期凋亡,晚期凋亡比例大于早期凋亡；TLR4 siRNA组和C23 siRNA组凋亡比例比RSV感染组凋亡比例下降,可见TLR4或C23阻断后,可以降低RSV感染N2a细胞的凋亡产生。(5)PFU结果显示,RSV感染N2a细胞培养上清中RSV滴度随感染时间的延长而逐渐增加；分别给予TLR4或C23 siRNA干扰后,RSV复制滴度水平较RSV感染组明显减少,TLR4 siRNA组较RSV感染组和C23 siRNA组病毒的滴度下降的更为明显,TLR4受体在识别RSV过程中可能具有更重要的作用。(6)ELSIA法结果显示,RSV感染组IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子随着感染时间的延长逐渐升高；转染TLR4 siRNA后,IL-6、IL-8和TNF-a的含量与RSV感染组同时间点相比降低更明显；在C23 siR NA组,IL-6、IL-8和TNF-α的含量与RSV感染组相比下降；沉默TLR4或C23受体表达可以减轻RSV感染过程中所产生的炎症反应。结论N2a细胞膜表面的TLR4和核仁素受体可以结合RSV F蛋白,从而识别病毒进入细胞,活化TLR4、TLR3、TLR7、NF-κB的表达,使下游细胞炎性因子IL-6、IL-8和TNF-a分泌升高,介导天然免疫反应的产生,导致神经元的损伤与凋亡

【关键词】：
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R56;R747.9
【目录】：

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1 黄升海;魏伟;云云;;呼吸道合胞病毒感染上调Toll样受体7和3基因的早期表达(英文)[J];微生物学报;2009年02期

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1 钟祥;李应东;王文辉;;Toll样受体介导的先天性抗病毒免疫反应研究进展[J];中国医药导刊;2012年03期

2 李涛;戴启刚;汪受传;;呼吸道合胞病毒与TLR3、TLR4的关系及其中医药研究进展[J];中华中医药杂志;2014年01期

3 徐凯;魏永鸽;;Toll样受体与感染性疾病[J];内江科技;2011年10期

4 孙寒丹;徐建亚;李佳曦;汪受传;;Toll样受体与呼吸道合胞病毒感染关系最新研究进展[J];辽宁中医药大学学报;2012年05期

5 孙亚娇;许家玲;夏荣耀;蒋哲;陈复辉;;成人病毒性社区获得性肺炎患者外周血TLR2/3/9的表达及临床意义[J];哈尔滨医科大学学报;2014年06期

6 王杰;张文斌;牟界;雷文汇;李芹;;松针对呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织TLR3、TLR4表达的影响[J];世界中医药;2015年01期

7 杨晓梅;吕伟伟;胡涛;黄升海;;呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化Toll样受体7介导的抗病毒作用研究[J];安徽医科大学学报;2012年06期

8 何小兵;房永祥;贾怀杰;陈国华;曾爽;景志忠;程国锋;;Toll样受体7介导的抗病毒天然免疫反应研究进展[J];中国兽医科学;2010年06期

9 高娴;李素云;王海峰;;Toll样受体与慢性阻塞性肺疾病发病机制的研究进展[J];中国老年学杂志;2012年09期

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3 郭智莉;DHV-Ⅰ对鸭巨噬细胞TLRs信号通路的影响[D];西南大学;2012年

4 李振兴;呼吸道合胞病毒感染小胶质细胞活化Toll样受体3、7介导炎性反应的初步研究[D];安徽医科大学;2013年

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6 贺欣;宋娜玲;孟爱民;;穿梭蛋白核仁素的多种生物学功能[J];医学综述;2012年13期

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2 Tatsuji Haneji;Kaya Yoshida;Hirohiko Okamura;Lihong Qiu;;凋亡的成骨细胞中核仁素与核仁组织区相关蛋白的分裂[A];中华口腔医学会第七届全国口腔病理学术会议论文摘要汇编[C];2006年

3 蒋碧梅;;核仁素对大鼠心肌缺血预适应中HSP70表达的影响及其机制[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年

4 支蕾;李艳;秘营昌;王敏;田征;饶青;;P53-核仁素复合物抑制富含鸟嘌呤的寡核苷酸的生物学作用[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

5 孙雪萍;姚扬明;夏春林;;RNA干扰核仁素对JNK抑制剂所致U251细胞增殖抑制和凋亡的影响[A];中国解剖学会2013年年会论文文摘汇编[C];2013年

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1 ;[N];医药导报;2008年

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本文编号：211410