慢性间歇性乏氧诱导心肌损伤的动态规律、机制及金属硫蛋白的保护作用

发布时间：2018-09-18 07:39

【摘要】：背景：阻塞性睡眠呼吸暂停（Obstructive sleep apnea, OSA）是临床常见的睡眠呼吸紊乱性疾病，主要表现为睡眠过程中反复出现的上气道完全或部分阻塞所致的呼吸暂停和呼吸浅慢，伴随乏氧、睡眠觉醒和血流动力学变化，其中，OSA所致的慢性间歇性乏氧（Chronic intermittent hypoxia, CIH）是引起其病理改变的主要成分。OSA是心血管疾病的独立危险因素，与心血管疾病的发病率及死亡率增高直接相关，因此，OSA已成为减少心血管疾病的公共健康干预的重要靶点。虽然OSA与多种心血管疾病密切相关，但OSA对心血管系统影响的动态过程及其机制尚未完全明了，目前认为，氧化应激是OSA所致心血管疾病的主要发病机制之一，我们推测：OSA对心血管系统的影响及其所致氧化应激存在时间依赖效应。金属硫蛋白（Metallothionein, MT）是一种非特异性、内源性、强有力的抗氧化剂，在包括心脏在内的多个器官中表达，我们推测：MT作为内源性抗氧化剂能通过其抗氧化作用保护OSA所致的心肌损伤。目前有关心脏对CIH的动态反应及MT在OSA所致心血管疾病中是否具有保护作用尚未见报道。目的：本研究应用CIH处理的小鼠模型模拟OSA患者的疾病状态。首先给予野生型FVB小鼠不同时间的CIH处理，旨在观察心脏对CIH反应的动态变化规律，以阐明心脏对CIH的反应是否存在时间依赖效应，并阐明CIH诱导的氧化应激是否为其诱导心肌损伤的主要发病机制。同时应用抗氧化剂治疗，进一步明确氧化应激在OSA所致心肌损伤中的作用，并应用心脏特异性过表达金属硫蛋白的转基因小鼠（Metallothionein-transgene, MT-TG）的CIH模型，观察MT对CIH所致心肌损伤是否具有保护作用，以明确MT作为内源性抗氧化剂是否能保护CIH所致的心肌损伤，从而进一步论证氧化应激在OSA所致心肌损伤中的机制，以期为临床预防及治疗OSA所致心血管疾病提供理论依据并试图寻找新的药物治疗靶点。方法：本研究共分三部分进行：1）应用CIH处理的野生型FVB小鼠模型，给予不同时间的CIH处理，分别从心脏的结构和功能及细胞和分子水平观察心脏对CIH的反应是否存在时间依赖效应并进行机制研究；2）应用抗氧化剂处理FVB小鼠，并给予CIH处理，拟阐明氧化应激在OSA所致心肌损伤中的作用；3）给予MT-TG鼠及其野生型FVB鼠CIH处理4周及8周，除进一步观察心脏对CIH反应的时间依赖效应外，同时观察心肌组织MT的过表达是否对CIH诱导的心肌损伤有保护作用，以进一步应用MT-TG鼠论证氧化应激在OSA所致心肌损伤中的作用。 1心脏对CIH反应的时间依赖效应为观察心脏对CIH反应的时间依赖效应，我们将8-10周雄性野生型FVB鼠暴露于CIH3天、7天（1周）、14天（2周）、21天（3周）、28天（4周）及56天（8周），动态观察下述指标的变化以明确心脏对CIH反应的时间依赖效应及其机制。（1）体重、心脏重量及心脏重量与胫骨长度比值：在不同时间点测量体重、心脏重量、胫骨长度，并计算心脏重量与胫骨长度比值作为心脏的相对重量，用以观察CIH是否影响动物生长并诱导心肌肥厚。（2）心肌肥厚标志基因检测：应用实时聚合酶链式反应（Real-time polymerasechain reaction, RT-PCR）及免疫印迹技术（Western-blot）检测心肌肥厚标志基因：心房利钠肽（Atrial natriuretic peptide, ANP）及β-肌红蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）的mRNA及ANP的蛋白质表达。（3）心脏结构及功能检测：应用超声心动图在不同时间点检测心脏结构及功能。（4）心肌纤维化检测：应用Western-blot技术检测纤维化相关指标：结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor, CTGF）及血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）的蛋白质表达，并应用天狼星红染色检测心肌组织胶原沉积。（5）心肌组织炎症检测：应用Western-blot技术检测炎症相关指标：细胞内粘附分子-1（Intracellular adhesion molecule-1, ICAM-1）及血管细胞粘附分子-1（Vascularcell adhesion molecule-1, VCAM-1）的蛋白质表达，并应用特异性萘酚A.S-D氯醋酸酯酶染色方法检测心肌中性粒细胞浸润。（6）心肌细胞凋亡检测：应用Western-blot技术检测凋亡相关指标：CIEBP同源蛋白（CIEBP homologous protein, CHOP）及裂解的Caspase-3（Cleaved-caspase-3, C-Cas-3）的蛋白表达，并应用TUNEL染色检测心肌组织凋亡阳性细胞浸润情况。（7）心肌氧化损伤检测：应用硫代巴比土酸方法检测心肌组织脂质过氧化指标丙二醛（Malondialdehyde, MDA）的含量，并应用Western-blot技术检测心肌组织抗氧化指标：MT、铜/锌过氧化物酶（SOD1）及核因子E2相关因子2（Nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2）的表达，同时应用免疫组化技术检测心肌组织MT的表达。 2CIH所致心肌损伤机制研究为明确CIH所致心肌损伤的机制，分别应用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)抑制剂Apocynin （3mg/Kg/日，腹腔注射，4周）及超氧化物歧化酶模拟剂MnTMPyP（5mg/Kg/日，腹腔注射，4周）处理FVB小鼠，并对部分鼠给予CIH4周，分别从大体标本、心功能及分子水平观察应用抗氧化剂后心脏对CIH的反应，以明确氧化应激在CIH所致心肌损伤中的作用。 3MT对CIH所致心肌损伤保护作用的研究为进一步明确氧化应激在CIH所致心肌损伤中的作用并探讨MT作为内源性抗氧化剂是否对CIH所致心肌损伤有保护作用，我们将8-10周雄性MT-TG鼠及年龄相应的野生型FVB鼠同时暴露于CIH4周及8周，观察MT-TG鼠心脏对CIH的反应，并通过在MT-TG鼠中观察到的保护作用进一步反证氧化应激在CIH所致心肌损伤中的作用。观察及检测指标同上。结果： 1野生型FVB鼠心脏对CIH反应的时间依赖效应（1）体重：对照组体重随年龄递增，CIH组体重在处理的相对早期（3天至3周）及晚期（8周）均明显低于对照组，4周时两组体重无显著差异。（2）心脏重量及心脏重量与胫骨长度比值：不同时间点，对照组及CIH组胫骨长度无显著差异，CIH组在暴露1周时心脏绝对重量及相对重量均显著低于对照组，随CIH暴露时间的延长，CIH组心脏绝对重量及相对重量逐渐增加，至CIH暴露4周时，明显高于对照组，说明CIH暴露4周可诱导心肌肥厚。（3）ANP及β-MHC的表达：CIH组3周时，ANP及β-MHC的mRNA表达及ANP的蛋白表达开始增加，与对照组比较有显著差异，4周时，上述指标表达量进行性增加，8周时，CIH组上述指标的表达量仍有增高，但两组间无显著性差异，该结果从分子水平证明了CIH暴露3周开始即可诱导心肌肥厚，4周时，可诱导包括心脏重量增加在内的显著的心肌肥厚。（4）心功能改变：CIH组暴露3天至3周时，心脏结构及功能无显著改变，4周时，舒张期及收缩期左室内径（Left ventricle cavitary dimensions, LVID）显著高于对照组，左室射血分数（Left ventricle ejection fraction, LVEF）及左室短轴缩短率（Leftventricle fraction shortening, LVFS）明显降低，8周时，CIH组舒张期室间隔厚度（Interventricle septem thickness, IVS）、舒张期及收缩期左室后壁厚度（Left ventricleposterior wall thickness, LVPW）明显低于对照组，舒张期及收缩期LVID进一步增加， LVEF及LVFS进行性下降，说明随着CIH暴露时间的延长，心脏逐渐从肥厚向扩张转化，左室收缩功能进行性减退。（5）心肌纤维化：在CIH暴露3天至3周时，CIH组心肌组织未见明显胶原沉积，4周及8周时，CIH组可见心肌组织胶原沉积，且8周明显重于4周，CTGF及PAI-1的蛋白表达在4周及8周时均明显高于对照组，说明自CIH暴露4周开始，心肌出现纤维化表现。（6）心肌炎症反应：CIH组暴露3天及1周时，心肌组织VCAM-1及ICAM-1的蛋白表达明显低于对照组，4周时，CIH组VCAM-1及ICAM-1的表达明显上调，且在心肌组织中可观察到中性粒细胞浸润，CIH暴露8周时心肌炎症反应消失。（7）心肌细胞凋亡：在CIH暴露3天至3周时，未见心肌细胞凋亡，4周时，，心肌组织CHOP的蛋白表达明显高于对照组，并在心肌组织中发现TUNEL染色阳性细胞，8周时，CIH组TUNEL染色阳性细胞增加，并伴有C-Cas-3的蛋白表达增加，说明自CIH暴露4周开始出现心肌细胞凋亡。（8）心肌氧化损伤：CIH组在暴露3天至3周时，心肌组织MDA含量与对照组比较无显著差异，但在CIH暴露4周至8周时，CIH组MDA的含量显著高于对照组，同时，心肌组织抗氧化指标Nrf2及MT的表达在CIH暴露3天时显著高于对照组，随着CIH暴露时间的延长, Nrf2及MT的表达逐渐下调，自CIH暴露3周开始，MT的表达开始下调，自CIH暴露4周开始，Nrf2的表达开始下调，8周时二者的表达进一步降低，SOD1的表达在CIH暴露3天至4周时，两组无显著差异，但在CIH暴露8周时，CIH组SOD1的表达亦明显降低，说明氧化损伤是CIH所致心肌损伤的主要发病机制，早期心表达下调是CIH所致心脏失代偿反应的主要原因。 2抗氧化剂治疗对CIH诱导的心肌损伤的保护作用应用抗氧化剂治疗后，对照组及CIH组体重、胫骨长度、心脏的绝对重量及相对重量以及心功能均未见显著差异，同时从分子水平对ANP、CTGF、PAI-1、VCAM-1的蛋白表达进行了检测，并检测了两组心肌组织MDA的含量，两组间比较均无显著性差异。结果提示，抗氧化剂对CIH所致心肌损伤有明确的保护作用，从而进一步证明氧化应激在介导CIH所致心肌损伤中的作用。 3MT对CIH诱导的心肌损伤的保护作用将MT-TG鼠暴露于CIH4周及8周发现，CIH组及对照组在不同时间点均未观察到体重、胫骨长度、心脏绝对重量及相对重量的变化。同时，在CIH组及对照组未观察到心肌肥厚、心肌纤维化、心肌细胞凋亡，心肌炎症反应及氧化损伤指标的变化。说明MT对CIH诱导的心肌损伤有保护作用，同时也进一步证明在CIH暴露期间，心肌组织MT表达的变化在CIH诱导的心脏代偿及失代偿反应中的作用以及氧化应激在CIH所致心肌损伤中的重要作用。结论： 1心脏对CIH的反应存在时间依赖效应，即在CIH暴露早期表现为代偿性反应，而在CIH暴露的相对晚期表现为失代偿性反应。 2氧化损伤是CIH所致心肌损伤的主要发病机制，机体抗氧化能力下降是引起氧化损伤的主要原因，应用NOX抑制剂及超氧化物歧化酶模拟剂可以抑制CIH所致心肌损伤。 3心肌组织MT的表达变化是心脏对CIH反应从代偿向失代偿转化的主要原因。 4MT作为内源性抗氧化剂对CIH所致心肌损伤有明确的保护作用。创新点： 1动态观察了心脏对CIH的反应，从细胞及分子水平系统阐述了心脏对CIH反应的时间依赖效应。 2进一步阐明氧化应激是CIH诱导心肌损伤的主要机制，机体抗氧化能力下降是引起氧化应激的主要原因。 3首次证明心肌组织MT表达的变化在CIH所致的心脏从代偿向失代偿转化中的作用。 4首次证明MT作为内源性抗氧化剂对CIH所致心肌损伤的保护作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R56;R541

【参考文献】