脂肪细胞因子对气道上皮炎症及免疫应激功能调控

发布时间：2018-10-20 18:02

【摘要】：肥胖和哮喘已成为世界范围内两大重要的公共卫生问题,流行病学资料显示两者间存在关联,肥胖时哮喘的发病率和严重程度增加,临床治疗难度加大,表明肥胖是哮喘的危险因素。肥胖时机体处于系统性炎症状态,哮喘病理本质上也是一种气道慢性炎症,存在免疫的异常激活和免疫失衡,据此我们推测,肥胖为哮喘的发生提供了适合的免疫炎症基础,从而增加哮喘的易感性。脂肪细胞因子(adipokines)是脂肪组织来源的一类特殊分泌蛋白,在肥胖时表达异常,参与多种肥胖相关疾病如2型糖尿病、动脉粥样硬化的发生发展,被认为是能量代谢与免疫炎症双通路的关键节点分子。深入探讨它们在肥胖哮喘中的作用可能为两者相关提供新的理论依据,为哮喘防治打开新思路。气道上皮细胞处于哮喘发病过程的起始环节,不仅作为机械屏障抵御外界有害刺激,还具有分泌细胞因子、抗原呈递等多种生物学功能。它在局部与T细胞交互作用,共同构筑了气道黏膜免疫系统,维持微环境的平衡和稳定。我们据此假设：脂肪细胞因子可能通过调节气道上皮免疫信号的传递而影响局部黏膜免疫状态,介导肥胖与哮喘相关。目的：为验证以上假设,本文拟①建立肥胖哮喘模型,观察三种脂肪细胞因子瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)和抵抗素(resistin)在肥胖哮喘时的表达水平,并分析它们与气道反应性、气道炎症的关系；②观察这三种脂肪细胞因子对支气管上皮细胞增殖、损伤修复和氧化性凋亡过程的调节并分析可能机制；③观察这三种脂肪细胞因子在气道免疫炎症信号传递中的作用,评价它们在气道黏膜免疫中的地位。方法与结果： 1.脂肪细胞因子对肥胖哮喘小鼠模型气道炎症的影响 (1)小鼠肥胖哮喘模型的建立和气道炎症鉴定：高脂饮食和OVA致敏激发建立C57BL/6J小鼠肥胖哮喘模型。实验分为正常对照组,单纯肥胖组、单纯哮喘组和肥胖哮喘组。称量体重、计算Lee's指数、肝脏油红O染色确定肥胖程度,Buxco系统检测肺功能,肺脏病理切片HE染色观察肺部炎症病理改变,并行支气管肺泡灌洗液(BALF)炎细胞计数分类以确立模型成功。结果显示,高脂饮食更易导致雌性小鼠肥胖,肥胖哮喘小鼠气道反应显著增高；肺部炎症性病理改变更加明显,BALF中蛋白和炎细胞大量渗出,相比单纯哮喘组炎症程度加重。 (2)脂肪细胞因子、Th细胞因子血清和BALF含量测定和相关分析：ELISA法检测血浆与BALF中瘦素、脂联素和抵抗素的含量,行Pearson相关分析评价它们的BALF水平和血浆水平的关系。结果显示,肥胖时瘦素在血浆和BALF中均增高,且两者呈正相关(R2=0.5669,P0.05)。对BALF中瘦素、脂联素、抵抗素与气道阻力、免疫炎症因子IFN-γ、IL-4、IL-17水平之间的相关性进行分析,结果表明,肥胖促进肺部炎症向Thl型偏移,BALF中脂联素含量与气道阻力负相关(R2=0.987,P0.05),与IFN-γ水平也呈负相关(R2=0.9146,P0.05),可能在气道具有抗炎保护效应。 2.脂肪细胞因子对HBECs增殖、损伤修复和凋亡的影响 (1)脂肪细胞因子脂联素影响支气管上皮细胞增殖和损伤修复：以瘦素、脂联素和抵抗素预处理细胞,MTT法检测细胞增殖活力,流式细胞术分析细胞周期,并24小时视频系统动态观察HBECs机械性缺损修复过程。结果显示,脂联素可显著促进细胞增殖,加速细胞周期(脂联素处理组G1期细胞减少了约10%,而S+G2期细胞从32.29%±1.78%增加到43.19%±3.81%,P0.05),并加速损伤修复过程。应用钙离子荧光探针对细胞进行标记,发现脂联素可以增加细胞内钙离子浓度,钙调素抑制剂预处理可阻断脂联素的促修复效应,表明钙离子/钙调素途径介导了脂联素对气道上皮细胞增殖、修复功能的调控。 (2)脂肪细胞因子对支气管上皮细胞氧化性凋亡的作用及机制分析：以Annexin V/PI双染试剂盒在流式细胞仪上检测臭氧应激引起的支气管上皮细胞凋亡,观察脂肪细胞因子预处理对氧化性凋亡的作用。结果显示,脂联素可以显著减少臭氧诱导的HBEC细胞凋亡,使臭氧应激引起的细胞凋亡从58.76%±3.06%降低至3.76%±1.31%,将细胞存活率从28.66%土2.42%提高至82.98%±3.96%,P0.05。利用活性氧探针标记支气管上皮细胞检测发现,脂联素预处理的细胞ROS水平下降。PCR结果表明支气管上皮细胞脂联素受体adipoR1呈优势表达,流式结果证实脂联素可逆转臭氧诱导的adipoR1减少,表明脂联素可能通过与其受体adipoRl之间的反馈调节作用影响支气管上皮细胞的氧化性凋亡。 3.脂肪细胞因子对支气管上皮细胞免疫信号传递的影响 (1)脂肪细胞因子对共培养淋巴细胞增殖的作用：以CFSE荧光探针标记淋巴细胞,并与支气管上皮细胞共培养,观察脂肪细胞因子预处理对淋巴细胞增殖的影响。CFSE荧光随增殖淋巴细胞传代而衰减,可反映淋巴细胞的不同增殖代数。流式结果表明,三种脂肪细胞因子作用于单独的或正常共培养的淋巴细胞不能影响其增殖,但在非变应性因素LPS刺激时,瘦素可促进淋巴细胞增殖。而脂联素则对增殖起抑制作用,使第一代淋巴细胞比例从LPS刺激时的17.47%±2.99%增高到26.04%±3.80%,P0.05。而在变应性OVA刺激时,未见三种脂肪细胞因子对淋巴细胞增殖有显著影响(P0.05)。 (2)脂肪细胞因子对共培养淋巴细胞CD4/CD8亚群分化比例的调节：以CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-Cy5三标抗体检测淋巴细胞CD4、CD8亚群比例。流式结果显示,与支气管上皮细胞共培养的悬浮淋巴细胞CD4比例相对下调,脂肪细胞因子对CD4、CD8各亚群比例和CD4/CD8比值没有影响(P0.05)。 (3)脂肪细胞因子对共培养淋巴细胞与支气管上皮细胞粘附的作用：以CD3-FITC抗体标记T淋巴细胞,光镜和荧光显微镜下观察其与支气管上皮细胞间的粘附,并以酶标仪和流式细胞术检测粘附率。结果显示,淋巴细胞可与支气管上皮细胞特异性粘附,似乎对CD4细胞更具选择性。瘦素在LPS和OVA刺激时对两者粘附的作用似乎呈现出相反的趋势,但无统计学差异。脂联素和抵抗素也不影响两种细胞间的粘附率(P0.05)。 (4)脂肪细胞因子对淋巴细胞Th细胞因子分泌的影响：ELISA法检测脂肪细胞因子对共培养淋巴细胞分泌IL-4、IFN-y和IL-17的影响。结果显示,在LPS刺激时,瘦素或抵抗素对共培养上清液中的IFN-Υ和IL-17的表达起促进作用；脂联素可减少IFN-y的产生,但也增加了IL-17生成。在OVA刺激时,瘦素促进共培养上清液中IFN-Υ、IL-17的分泌,抵抗素降低IFN-Υ的生成,但增加了IL-17的分泌水平。脂联素可降低IFN-Υ的表达水平、对IL-17的分泌没有影响。三种脂肪细胞因子均对IL-4的分泌没有调节作用。 (5)脂肪细胞因子对HBECs摄取OVA和表达TLR4蛋白的影响：荧光显微镜下观察FITC-OVA的摄取,流式细胞术定量分析。结果显示,三种因子不影响HBECs对OVA的摄取。流式细胞结果也表明,LPS刺激HBEC可诱导TLR4表达上调(平均荧光强度26.54±3.62),而加入脂联素后TLR4的表达有下降趋势(平均荧光强度19.9±1.97),P0.05,有统计学差异。 (6)脂肪细胞因子对HBECs中B7分子表达谱的影响：FLeal-timePCR结果显示,adipokines预处理后HBECs中B7家族各分子表达水平没有显著改变,但脂联素作用下表现出CD80/D86匕值相对降低、PD-L1/PD-L2比值相对升高的趋势(P0.05),也许介导了脂联素的免疫调节功能。 (7)脂肪细胞因子对支气管上皮细胞TSLP分泌的影响：ELISA结果表明,OVA可刺激支气管上皮细胞TSLP的分泌。在不论刺激物为LPS或是OVA,三种脂肪细胞因子对TSLP的分泌均无显著影响(P0.05)。提示TSLP以外的信号途径介导脂肪细胞因子对HBECs免疫功能的间接调节。结论： 1.肥胖可加重哮喘气道反应性和局部炎症,支气管肺泡灌洗液中的脂联素与气道阻力、Thl型炎症密切相关,在气道局部可能具有抗炎效应。 2.脂联素可促进支气管上皮细胞增殖,加速机械性损伤后修复过程,抵抗氧化损伤和凋亡,具有气道保护作用。 3.脂肪细胞因子作用于支气管上皮细胞免疫信号传递的不同方面,与淋巴细胞交互作用,参与气道黏膜免疫调控。全文共有图40幅,表10个,参考文献216篇。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R562.25;R589.2

【参考文献】