细胞外超氧化物歧化酶对内毒素所致氧化应激及肺部炎症的抑制作用

发布时间：2018-10-24 09:13

【摘要】：革兰阴性杆菌感染可导致败血症、感染性休克甚至多器官功能衰竭,LPS(lipopolysaccharide,脂多糖)在发病机制中占有重要地位。LPS是革兰阴性菌细胞壁的正常结构成分,临床上又称为内毒素。在严重创伤、感染等应激状态下,大量内毒素释放入血,从而启动炎症和损伤。研究LPS致病机制及抑制LPS对机体的损伤在临床上具有重要意义。 LPS介导炎性介质IL-1(interleukin-1,白介素-1)、TNF-a (tumor necrosis factor alpha,肿瘤坏死因子-α等的表达,进一步促进NO (nitric oxide,一氧化氮)、TNF-α、白细胞介素、自由基等毒性细胞因子的释放,从而导致机体产生氧化应激与炎症反应。在炎症反应过程中伴有大量自由基产生,包括超氧阴离子、过氧化氢物、氢自由基、NO等,能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而发生脂质过氧化反应,破坏脂肪酸链和细胞膜的完整性,损伤细胞。炎症是机体对各种有害刺激所产生的一种以防御为主的病理反应。血管反应是炎症过程的中心环节。有着强大分泌功能的血管内皮细胞在革兰阴性杆菌感染中有着重要的地位。内毒素休克发生后,有效循环血量的减少和微血管通透性的增加是休克发生发展、最后导致组织损伤和器官功能损害的特征性表现。微血管通透性的增加主要取决于内皮细胞单层的形态及细胞连接。炎症过程的一个重要特征就是白细胞粘附、穿越血管内皮细胞,向炎症部位渗出。这一过程的重要分子基础是白细胞与血管内皮细胞粘附分子的相互作用。内毒素能诱导血管内皮细胞氧化应激,启动粘附分子VCAM-1(vascular celll adhesion moleculer-1,血管细胞粘附分子-1)的表达。内皮细胞表面的VCAM-1再介导白细胞和内皮细胞的粘附,从而导致血管内皮损伤,最终引起血管通透性增加,白细胞向组织内迁移,大量白细胞浸润,造成组织广泛性损伤,形成LPS诱导的多脏器功能损害。以上病理过程表明,氧化应激反应在内毒素等引起的炎症及组织损伤中起重要作用,也提示,抑制氧化应激反应可能成为一个治疗路径,来控制革兰阴性杆菌感染导致的机体损伤。 ECSOD (extracellular superoxide dismutase,细胞外超氧化物歧化酶)又称SOD3,可清除02-生成H202和02,H202在过氧化氮酶或过氧化物酶和还原剂的作用下生成无毒性的H2O,从而达到保护细胞和机体组织的作用。ROS(reactive oxygen species,活性氧)和内皮损伤在败血症导致多脏器功能障碍综合征的发病机制中的重要性说明胞外ROS是主角。既然ECSOD为结合到血管内皮和多个器官细胞外基质的主要的SOD,我们设想肌肉来源的ECSOD能在疾病中发挥保护性作用。因此我们用TNF-a体外刺激血管内皮细胞,用LPS攻击C57BL/6小鼠和肌肉来源ECSOD转基因小鼠,观察由此引起的氧化应激反应、血管粘附因子的表达、血管内皮细胞及器官病理改变,研究分析ECSOD的作用及机制,有以下发现： 1. ECSOD转基因小鼠血清中含有高浓度ECSOD。Western Blot检测发现,ECSOD-TG(transgene,转基因)小鼠血清中ECSOD的表达含量远高于WKwide type,野生型)C57BL/6小鼠血清。还在ECSOD基因转染的HCECs(human cardiac endothelial cells,人心脏内皮细胞)以及ECSOD-TG小鼠血清孵育后的未转染ECSOD基因的HCECs表面,检出ECSOD,为后续开展HCECs的有关研究奠定方法学基础。 2. ECSOD能抑制TNF-α引起的氧化应激反应。HCECs在接受TNF-α刺激后迅速出现ROS (reactive oxygen species,活性氧)显著升高,而这种瞬时升高现象并未出现在ECSOD血清提前共孵育的实验组；在观察TNF-α刺激延迟反应时,HCECs加入TNF-α刺激4小时后,ECSOD降低了内皮细胞在TNF-α刺激后的ROS生成。 3. ECSOD能抑制TNF-α引起的VCAM-1表达。TNF-α刺激后HCECs的VCAM-1表达增加,但在ECSOD存在的条件下,HCECs无论TNF-α刺激与否,VCAM-1的表达均未明显增加；人单核细胞系THP-1细胞和内皮细胞在TNF-α刺激下的细胞间粘附反应在ECSOD存在的条件下也受到抑制,提示ECSOD抑制TNF-α诱导的氧化应激,抑制血管粘附因子的生成及单核细胞和内皮细胞的粘附。 4. ECSOD对LPS攻击具有一定保护作用。ECSOD转基因小鼠接受LPS20mg/kg腹腔注射,存活率明显高于WT小鼠。 5. ECSOD能改善LPS引起的白细胞浸润和肺组织损伤。 (1)WT小鼠在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小时后,肺部组织出现明显充血和白细胞浸润,ECSOD转基因小鼠在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小时后,肺部组织表现基本正常。 (2)4-HNE(4-hydroxynonenal,4-羟基壬烯酸)免疫组化染色显示,在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小时后,WT小鼠肺部组织产生大量4-HNE, ECSOD转基因小鼠肺部组织仅有少量4-HNE存在,提示LPS引起的组织氧化应激反应受ECSOD抑制与肺部组织损伤改善有关。 (3) VCAM-1免疫组化染色显示,在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小时后,WT小鼠肺部组织动、静脉血管内皮细胞VCAM-1产生明显增加,ECSOD转基因小鼠的表现为相对少量的VCAM-1的产生,与肺部组织在氧化应激反应被ECSOD抑制后白细胞浸润减少有相关性。总之,本文在细胞学水平研究发现,内皮细胞HCECs在TNF-α刺激后,产生ROS增加(包括瞬间反应和延迟反应),内皮细胞VCAM-1的表达增加,EC-SOD能减少这种情况下内皮细胞ROS的生成和VCAM-1的表达,反映出我们所用的转基因小鼠产生的肌肉来源的ECSOD对氧化应激反应的有抑制,及相应的白细胞和内皮细胞粘附减少的现象;在动物实验水平研究发现,C57BL/6小鼠接受LPS腹腔注射后,肺部氧化应激产物增加、VCAM-1表达上调,肺组织充血、白细胞浸润等炎症表现明显,而ECSOD转基因小鼠对LPS刺激的反应则明显弱于前者,表现出显著增高的存活率,提示肌源性ECSOD对LPS攻击造成的致死性损伤有一定保护作用：同时此ECSOD可能通过抑制炎症反应和氧化应激而减轻肺组织损伤。据此,我们认为ECSOD作为有效的胞外氧化抑制剂,通过抑制内毒素诱导的氧化应激反应,稳定血管内皮功能,下调血管内皮粘附因子表达,减少白细胞对血管内皮细胞的粘附,从而降低白细胞的迁移率,改善组织炎症损伤,在革兰阴性杆菌的感染中起到了保护作用。这对于革兰阴性杆菌感染致败血症甚至多脏器功能损伤的发病机制的研究及探索临床上细胞外抗氧化措施在抗感染治疗中的作用有潜在应用价值。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563

【参考文献】