【摘要】：研究背景:肺微血管内皮细胞组成的内皮屏障,维持着肺间质与血液中的渗透压平衡,调控着血液中炎症细胞、蛋白等物质的运输。各种因素导致的内皮连接破坏、内皮细胞凋亡及坏死破坏了内皮屏障的完整性,影响了内皮屏障功能,导致了血浆蛋白及致炎因子渗出、肺间质及肺泡水肿。故内皮完整性的破坏及内皮渗透性的增高是急性肺损伤重要发病病理基础之一,研究其发生机制,有利于急性肺损伤的干预及治疗。革兰氏阴性杆菌感染是急性肺损伤的重要诱发因素之一,革兰氏阴性杆菌的崩解产物脂多糖(LPS)是炎症反应的重要促发因子,其可与细胞表面TLR4受体特异性结合,激活TLR4-NF-κB信号通路并由此诱导细胞对其产生应答反应,过度激活的TLR4-NF-κB信号将导致炎症的发生和发展。另外,TLR4不仅能识别LPS等病原体相关分子模式,其对于无菌性损伤后产生的内源性致炎因子即损伤相关分子模式也有应答反应。故TLR4不仅能应答由革兰氏阴性杆菌感染所引起的炎症反应,也能应答由非特异损伤导致的无菌性炎症。由此可见,在急性肺损伤中,TLR4及其下游信号通路的激活及失控可能在炎症的发生、发展及失控中发挥重要作用。既往研究表明:TLR4可在肺微血管内皮细胞上表达,参与了多种炎症信号的传递过程,将TLR4过表达后将加重肺损伤,而抑制TLR4信号传递后可以阻止肺微血管内皮细胞骨架蛋白的重排,抑制细胞间缝隙的形成并由此减轻或阻止肺水肿的发生。故TLR4可能成为急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合症治疗中一个重要的干预靶点。Rab蛋白是一类小GTP结合蛋白,具有GTP酶活性,故又称为Rab GTPase,其能调控细胞内囊泡结构的运输,并由此调控囊泡内蛋白质在细胞中的转运。不同的Rab蛋白具有不同的功能,我们先前的研究揭示了,Rab1可调控β2-肾上腺素受体及血管紧张素II 1型受体在大鼠肺动脉平滑肌细胞膜及细胞内的分布,Rab5a可调节β2-肾上腺素受体在肺微血管内皮细胞中的转运及胞膜上的表达,也能够调节该细胞中VE-cadherin的内吞及F-actin的定位。而Rab26是一种主要调控顺向转运的Rab蛋白,可以调控囊泡从高尔基体到细胞膜的转运。而TLR4作为膜受体在细胞内合成后需转运至胞膜才能应答配体传递的刺激,那么,Rab26能否调节肺微血管内皮细胞中TLR4受体的转运和表达,继而引起其对LPS等致炎因子应答的改变,并由此调控肺微血管内皮细胞屏障功能?目前尚不清楚。纳米材料在医学研究及诊治中有着巨大的应用前景。早期的研究主要集中在无机纳米材料的应用方面,例如常见的有纳米金在诊断中的应用及纳米银在抗菌方面的应用等。因纳米材料具有多种特有的优势,在生命科学领域,近几十年来各种先进的纳米材料被合成。而通过DNA碱基互补配对自组装而成的纳米材料,因其具有成本低廉、组装容易、易编程、可修饰等特性,非常便于在医学研究以及诊断治疗的应用,而其作为载体在递送siRNA进行研究和基因诊断治疗方面有着低毒、低免疫原性、血清稳定性佳等独特优势。在本研究中,我们合成了两种纳米载体ssRNA-TNP及siRab26-DYM,分别探讨了这两种纳米载体与单一siRNA相比的应用优势。并使用纳米载体研究了Rab26对LPS引起的肺微血管内皮细胞TLR4及NF-κB P65变化所产生影响。然后,我们还检测了Rab26对肺微血管内皮细胞凋亡及渗透性的影响,进一步明确了Rab26在肺微血管内皮细胞应对炎症因子刺激时所发挥的作用。研究目的:1.合成具有低毒性及良好转染效果的DNA自组装纳米载体。2.明确Rab26对HPMVECs中TLR4及下游信号通路的调节作用。3.探讨Rab26对HPMVECs细胞凋亡及内皮细胞渗透性的影响。研究方法:1.构建并验证DNA自组装纳米载体。(1)构建能够携带mTOR siRNA的DNA三角板纳米载体,检测其产率、转染效率及细胞摄取率。(2)构建能够稳定转运Rab26siRNA的DNA三臂Y型模体结构纳米载体siRab26-DYM,并检测其纳米载体产率、转染效率及细胞摄取率。(3)使用RT-PCR及WB检测siRab26-DYM对HPMVECs细胞中Rab26基因表达的干扰效果。2.培养人肺微血管内皮细胞,检测LPS及Rab26对HPMVECs细胞Rab26、TLR4及其下游信号通路的影响。(1)使用Westernblot探测HPMVECs中Rab26及TLR4的表达变化。(2)采用流式细胞术检测HPMVECs细胞膜TLR4的改变。(3)使用流式细胞术检测Rab26对HPMVECs细胞膜TLR4受体的调节作用。(4)使用WB检测Rab26对HPMVECs细胞总TLR4蛋白及其下游通路分子NF-κB P65的调控。3.检测LPS及Rab26对HPMVECs细胞凋亡率及其内皮细胞渗透性的影响(1)使用流式细胞术检测Rab26对HPMVECs细胞凋亡率的影响。(2)使用Transwell小室培养HPMVECs,通过检测FITC-dextran的透过率以反映HPMVECs内皮细胞通透性。研究结果:1.成功组装了能携带mTOR siRNA的DNA自组装三角板纳米载体以及能携带Rab26siRNA的Y形模体结构纳米载体。凝胶电泳结果分析显示:通过阶梯降温法纳米载体能完成自组装并达到较高的产率。2.携带mTOR siRNA的DNA自组装三角板纳米载体以及携带Rab26siRNA的Y型模体纳米载体能被细胞高效摄入。通过对携带Rab26siRNA的Y型模体纳米载体的进一步研究发现,其能高效沉默目的基因Rab26的表达,且具有浓度及时间依赖性,RT-PCR及Westernblot结果显示此种纳米载体能导致HPMVECs细胞中目的基因Rab26在mRNA及蛋白水平的表达下降。3.LPS处理HPMVECs后Rab26的表达出现了下降,细胞膜TLR4及细胞总TLR4蛋白的表达出现了上升。4.下调HPMVECs细胞中Rab26能提高细胞膜TLR4、细胞总TLR4以及下游NF-κB P65的表达,而上调HPMVECs细胞中的Rab26能降低由LPS引起的TLR4及NF-κB P65的升高。5.LPS处理HPMVECs后,细胞的凋亡率增高,而下调HPMVECs细胞Rab26的表达,能与LPS协同作用提高HPMVECs细胞的凋亡,上调HPMVECs细胞中Rab26能降低LPS刺激后出现的细胞凋亡。6.LPS刺激后,HPMVECs细胞渗透性出现了提高,而下调Rab26能与LPS协同作用进一步提高HPMVECs内皮细胞渗透性,上调Rab26能一定程度降低由LPS刺激所导致的HPMVECs内皮细胞渗透性的提高。结论:1.成功构建能够自组装的携带mTOR siRNA的DNA自组装三角板纳米载体及能携带Rab26siRNA的DNA纳米Y型模体纳米载体,其合成方法简单,产率高,这两种纳米载体能够高效的转入细胞。对携带Rab26siRNA的DNA纳米Y型模体纳米载体的进一步研究发现,其能高效的干扰目标基因的表达。2.LPS可降低HPMVECs中Rab26的表达,提高TLR4及NF-κB的表达。而Rab26的降低将导致TLR4及NF-κB的表达增加。3.Rab26可调节由LPS导致的HPMVECs中细胞凋亡及渗透性的改变。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563
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本文编号：
2343453
