microRNA-146a通过靶向TLR4-IRAK-NF-κB信号通路调节LPS诱导大鼠远端肺动脉平滑肌细胞合成分泌细

发布时间：2018-11-20 07:52

【摘要】：目的:测定脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导下大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中micro RNA-146a表达水平的动态变化;通过质粒转染的方法检测外源性高表达micro RNA-146a是否可通过靶向TLR4信号通路调节LPS诱导下PASMCs的合成分泌细胞因子。方法:第一部分:1、以气道内注入LPS叠加香烟烟雾暴露法建立COPD大鼠模型,进一步分离、培养原代COPD大鼠PASMCs,将第4、5代PASMCs用于后续研究;2、将PASMCs分为两组:(1)正常组:不做任何处理;(2)LPS诱导组:加入配制好的LPS,使其终浓度为1μg/ml;各组细胞分别培养12小时(12 h)、24小时(24 h)、48小时(48 h)、72小时(72 h),收集细胞提取总RNA,Real-time PCR法检测各组细胞中micro RNA-146a表达。第二部分:通过质粒转染的方法将外源性micro RNA-146a导入PASMCs,Real-time PCR检测micro RNA-146a转染率,证实最佳转染浓度及时间。设立实验分组:(1)正常组:未做任何处理;(2)LPS诱导组:加入配制好的LPS,终浓度为1μg/ml;(3)micro RNA-146a组:转染micro RNA-146a质粒,转染6小时后换成完全培养基;(4)LPS+micro RNA-146a错义链组:转染micro RNA-146a错义链质粒,6小时后换成完全培养基,加入LPS(终浓度1μg/ml);(5)LPS+lipofectamine2000组:给予相同剂量PBS及lipofectamine 2000并加入LPS(终浓度1μg/ml);(6)LPS+micro RNA-146a组:转染micro RNA-146a质粒,6小时后换成完全培养基,加入LPS(终浓度1μg/ml);(7)micro RNA-146a错义链组:转染micro RNA-146a错义链质粒,转染6小时后换成完全培养基;(8)lipofectamine2000组:给予相同剂量PBS及lipofectamine2000培养。收集各组细胞及细胞的培养上清液:Western Blot法检测各组细胞中TLR4、IRAK-1、IKK、IκB、NF-κB的蛋白表达;ELISA检测各组细胞上清液中γ-干扰素(IFN-γ)、血小板衍生生长因子-AB(PDGF-AB)、白细胞介素-6(IL-6)的含量;并将LPS+micro RNA-146a组中各蛋白的表达水平与IFN-γ、PDGF-AB、IL-6的分泌量进行相关性分析。结果:第一部分:与正常组相比,LPS诱导下PASMCs中micro RNA-146a表达量有递增趋势,自培养12小时开始升高,72小时可维持在较高水平(P0.01);第二部分:1、通过质粒转染法,证实当质粒与lipofectamine2000的转染比例为1:2,转染至48小时,PASMCs中micro RNA-146a的表达量最高,其表达量约为正常组的18倍,差异有统计学意义(P0.01);以此浓度配比及转染时间为最佳浓度及时间进行外源性micro RNA-146a的PASMCs内转染。2、micro RNA-146a质粒转染并予LPS诱导PASMCs,培养48小时;结果显示:(1)与正常组相比,LPS诱导后各组(LPS组、LPS+micro RNA-146a错义链组及LPS+lipofectamine2000组)细胞内TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的NF-κB(P65)蛋白表达水平明显增加(P0.01);而LPS+micro RNA-146a组分别与相同条件下LPS诱导组(LPS组、LPS+micro RNA-146a错义链组及LPS+lipofectamine2000组)比较,TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的P65蛋白表达水平明显下调(P0.05)。(2)与正常组相比,LPS诱导组(LPS组、LPS+micro RNA-146a错义链组及LPS+lipofectamine2000组)细胞培养上清液中IFN-γ、PDGF-AB、IL-6分泌量明显增加(P0.01);而转染外源性micro RNA-146a后,可见micro RNA-146a+LPS组分别与LPS组、LPS+micro RNA-146a错义链组及LPS+lipofectamine2000组相比,其细胞培养上清液中IFN-γ、PDGF-AB分泌量明显降低(P0.01),IL-6的分泌量没有降低,而是与LPS诱导组一样呈明显升高趋势(P0.01)。(3)将LPS+micro RNA-146a组中各蛋白表达量与其细胞上清液中细胞因子含量进行相关性分析,可见TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的P65蛋白表达量与细胞上清液中IFN-γ、PDGF-AB含量呈正相关,且差异有统计学意义(P0.05);而细胞上清液中IL-6的分泌量除了只与磷酸化的IKK蛋白表达量呈负相关外(P0.05),与其他蛋白的表达量无明显相关性。结论:1、LPS能诱导肺动脉平滑肌细胞中micro RNA-146a的表达上调,于72小时维持在较高水平;2外源性micro RNA-146a可负性调节TLR4信号通路中相关分子的蛋白表达,进而通过TLR4-IRAK-IKK-IκB-NF-κB信号通路下调肺动脉平滑肌细胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB,但IL-6水平不降反有升高,其原因还待进一步研究。
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【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.9

【参考文献】