TGF-β受体亚型糖基化修饰对肺间质纤维化发生发展的影响

发布时间：2018-12-12 13:57

【摘要】：特发性肺间质纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）严重威胁人类健康和生命，其发病率呈逐渐上升趋势，死亡率高。由于其发病机制不十分清楚，目前尚无有效的治疗方法。虽然肺组织已形成的纤维化不可逆转，但肺间质纤维化是一个慢性的、进行性的病理反应过程，探索肺间质纤维化发病的分子机制及新的干预靶点以延缓或阻止肺纤维化进展的策略，仍具有重要的实际意义，是国际肺科学界一直关注的焦点。在肺纤维化的发展过程中，转化生长因子-β(Transforming growth factor β，TGF-β)起着关键作用。活化的TGF-β，在Ⅲ型受体的调节作用下，首先与肺成纤维细胞膜上的2个Ⅱ型受体结合，再募集2个Ⅰ型受体形成复合体，磷酸化Ⅰ型受体的激活型G蛋白（stimulatory G protein，Gs）功能域，成为活化状态，活化的Ⅰ型受体进一步磷酸化下游信号分子Smads蛋白。但具体哪几个TGF-βⅠ型受体亚型参与肺纤维化的过程尚不清楚。通过基因芯片技术，我们对博来霉素致大鼠肺间质纤维化模型中7个TGF-βⅠ型受体亚型（又称活化样受体样激酶，activin receptor-like kinase，ALK)的研究发现：ALK4，ALK5，ALK7表达增高，为进一步明确以上三种TGF-βⅠ型受体亚型肺间质纤维化发生和发展中的分布和变化规律，我们应用实时定量PCR和蛋白免疫印记、免疫组化技术分析ALK4，ALK5和ALK7在纤维化不同时期的表达变化。对ALK5的结构研究发现其表面存在核心岩藻糖基化修饰位点，TGF-βRII也属于糖蛋白，它须经过由α-1，6岩藻糖基转移(α1,6-fucosyltransferase8，FUT8)催化的核心岩藻糖基化修饰，然后才具备与TGF-β1结合的功能。因此，FUT8是TGF-β受体糖基化修饰的重要酶。FUT8还可以促进间充质转分化和细胞外基质沉积，对纤维化的发生发展发挥着重要作用。而FUT8在肺间质纤维化中的研究少见报道。我们利用TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞WI-38纤维化模型，来研究两种受到核心糖基化修饰的TGF-βRI(ALK5)和TGF-βRⅡ，探讨它们的糖基化修饰作用是否参与了TGF-β1诱导的肺间质纤维化过程。 IPF不仅病因谱极为广泛和复杂，同时在进展过程中存在多个病理生理过程参与、多个信号通路活化，因此，从理论上来讲，其治疗也应该是多靶点的，单一阻抑某一个靶点，或某一种发病机制，或某个信号传导通路可能获得部分疗效，但不能最终阻止肺纤维化的进展。而蛋白质的糖基化修饰可以作用于多个蛋白靶点，从而实现疾病状态下的多靶点的同时调控。目前国内外治疗IPF的传统方法是糖皮质激素和免疫抑制剂，疗效不佳。多味中药联合因其化学成分多样，药理活性广泛，作用多靶点及多效性、意向性及毒副作用小等特点，非常符合多靶点治疗肺纤维化策略。活血化瘀法为中医学八大治则之一，众多医家尝试用血府逐瘀汤等这些方剂学中有名的活血化瘀方剂治疗肺纤维化，均取得了不错的疗效。组方中当归等可以干扰TGF-β/Smad2/3信号通路对基因表达、蛋白合成的调节，实现对大鼠肺纤维化的治疗作用。而在TGF-β/Smad2/3信号通路中，受体的糖基化修饰是TGF-β发挥重要生物学作用的关键步骤。我们应用现代医学手段去探讨活血化瘀方剂对TGF-β受体糖基化修饰的影响，，为活血化瘀方剂治疗肺间质纤维化提供理论依据。第一部分探讨ALK4，ALK5，ALK7在博来霉素致大鼠肺间质纤维化中的表达目的：明确TGF-βⅠ型受体亚型（ALK4，ALK5，ALK7）在正常大鼠肺组织和博来霉素诱导的大鼠肺间质纤维化肺组织中的分布和变化规律；探讨特异性TGF-βⅠ型受体亚型在肺间质纤维化中的表达，综合分析TGF-βⅠ型受体亚型在肺间质纤维化发生和发展中的分布和变化规律，为防治肺间质纤维化提供新的理论依据。方法：雌性SD大鼠56只，采用随机数字表法分为正常对照组（N组）和肺间质纤维化模型组（1，3，7，14，28，35天组），每组7只。对肺组织进行石蜡包埋组织学检测，同时应用实时定量PCR和蛋白免疫印记、免疫组化技术分析ALK4，ALK5和ALK7在纤维化不同时期的表达变化。结果：ALK-4、ALK-5和ALK-7mRNA和蛋白表达于第1天出现上升并随纤维化时间延长逐渐增高，ALK-4于14天达到最高峰，在第28天有所回落，而ALK-5和ALK-7于28天达到最高峰，在第35天有所回落。免疫组化可见ALK4，ALK5和ALK7在正常和纤维化时的肺泡上皮细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞上均有表达。结论：ALK4，ALK5和ALK7均在肺间质纤维化的发生发展过程中高表达。第二部分探讨FUT8对肺间质纤维化ALK5/TGF-βRII/Smad2/3转导通路的影响目的：利用TGF-β1诱导的肺成纤维细胞肌成纤维细胞表型转化模型，研究两种TGF-β受体—TGF-βRII和TGF-βRI(ALK5)核心岩藻糖基化修饰，探讨它们的糖基化修饰作用是否参与了TGF-β1诱导的人胚胎肺成纤维细胞（humanembryonic lung fibroblasts WI-38）细胞向肌成纤维细胞转化；阻断TGF-β受体的糖基化修饰是否可以阻断Smad2/3信号转导，减少其下游MMP-9，TIMP-1的表达。方法：体外培养的WI-38细胞随机分为六组：(1)N组，单独的DMEM培养；(2) FUT8-siRNA组,转染FUT8-siRNA并持续孵育72h；(3) TGF组,加入浓度为10ng/ml的TGF-β1孵育48h；(4) TGFM组,首先用乱序siRNA转染细胞并孵育24h，然后加入10ng/ml TGF-β1继续孵育48h；(5) TGFFs组，先用FUT8-siRNA转染细胞并孵育24h，然后加入10ng/ml TGF-β1继续孵育48h；（6）TGFFs F组，FUT8-siRNA转染细胞并孵育24h，然后加入10ng/ml TGF-β148h后加入；加入Fut8蛋白5ng/ml继续孵育24小时。我们用免疫荧光的方法确定了WI-38细胞表面有丰富的核心岩藻糖链表达，然后用流式细胞仪检测a-SMA，用实时定量PCR技术，免疫印记技术、免疫荧光检测FUT8-siRNA干扰后各组细胞的ALK5，TGF-βRII和核心岩藻糖链表达,用实时定量PCR技术、免疫印记技术检测p-Smad2/3，MMP-9，TIMP-1的变化。结果：加入TGF-β1导致WI-38细胞发生明显的形态学改变，可见细胞肥大、拉长；TGF-β1刺激能够增加WI-38细胞FUT8-siRNA以及蛋白表达水平，能激活TGF-β/Smad2/3信号转导途径，上调TGF-β-RII和ALK5蛋白表达水平，最终导致WI-38细胞中p-Smad2/3表达水平升高；FUT8-siRNA可以一定程度的抑制由于TGF-β1所致肌成纤维细胞表型转化的形态学变化，与对照组相比，TGFF组细胞基本保持正常的成纤维细胞形态；FUT8-siRNA能有效抑制p-smad2/3过表达，FUT8-siRNA能抑制TGF-βRII和ALK5的核心糖基化表达水平，但对由于TGF-β1所致的二者蛋白增高没有影响； FUT8-siRNA能够明显削弱由TGF-β1导致的WI-38细胞的α-SMA，MMP-9和TIMP-1的高表达,以上的抑制作用可以通过加入外源性FUT8缓解。结论：沉默FUT8基因能够抑制TGF-βRⅡ和ALK5的核心岩藻糖基化修饰，导致致纤维化细胞因子途径TGF-β/Smad2/3信号转导途径的激活受到抑制，最后使抑制WI-38细胞的肌成纤维细胞表型转化，并使TGF-β/Smad2/3下游的α-SMA，MMP-9和TIMP-1的表达。这些发现为我们进一步认识肺间质纤维化的翻译后修饰机制提供了线索，可能成为一种新的抗肺间质纤维化的治疗策略。第三部分探讨活血化瘀方剂对肺成纤维细胞TGF-β/Smad2/3糖基化修饰的影响目的：明确活血化瘀方剂是否影响TGF-β/Smad2/3信号通路中TGF-β受体糖基化修饰，用现代医学手段阐明活血化瘀方剂治疗肺间质纤维化的机理。方法：WI-38细胞随机分为三组：(1)N组,单独的DMEM培养;(2) TGF组,加入浓度为10ng/ml的TGF-β1孵育48h;(3) TGFH组,先用10%含药血清孵育24h，然后加入10ng/ml TGF-β1继续孵育48h，应用荧光定量PCR、免疫荧光、免疫印记技术检测WI-38细胞的FUT8、细胞的岩藻糖基化水平，TGF-β受体ALK5及TGF-βRⅡ的表达，应用ELISIA技术检测细胞培养液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维（collagenⅠ、Ⅲ、Ⅳ，COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ）和FN的变化。结果：活血化瘀方剂能明显地抑制WI-38细胞的FUT8的表达和细胞的岩藻糖基化水平，活血化瘀方剂对TGF-β受体ALK5及TGF-βRⅡ的表达无明显影响，但可以减少TGF-β1对WI-38细胞p-Smad2/3的影响，使其表达降低。COLⅠ在TGF组中表达约为正常组的1.5倍，TGFH组略高于正常组；COLⅢ在TGF组中表达约为正常组的2.5倍，TGFH组略高于正常组；COLⅣ在TGF组中表达约为正常组的1倍，TGFH组略高于正常组；FN在TGF组中表达约为正常组的2.5倍，TGFH组略高于正常组。结论：1、活血化瘀方剂可以抑制TGF-β孵育后肺成纤维细胞ALK5/TGF-βRⅡ-smad2/3信号通路的糖基化修饰。 2、活血化瘀方剂可以减少TGF-β孵育后肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维和FN的表达。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.9

【参考文献】