法呢基硫代水杨酸对哮喘小鼠气道炎症，气道重塑和Th细胞分化的影响及其机制的初步研究

发布时间：2018-12-12 15:49

【摘要】：背景：支气管哮喘是一种由多种细胞及细胞因子参与的慢性气道炎症性疾病,其病因复杂,发病机制至今尚未完全清楚,涉及到免疫学、神经内分泌学、遗传、环境等多种因素。气道炎症,气道高反应性,气道重塑是其三个基本特征。目前有关Ras通路与哮喘的关系的研究逐渐成为热点。Ras作为细胞生长分化的主要调节者,在细胞外刺激产生的信号转导通路中处于中枢地位。已有研究显示Ras介导的各下游信号传导通路在支气管哮喘发生发展的各个环节中均发挥重要作用。研究Ras信号转导通路有助于寻求新的药物作用靶点。 Ras信号传导通路主要由以下几条途径组成：1.丝裂原活化蛋白激酶信号通路(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)。Ras-MAPK通路是目前最为明确的信号通路。细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal regulated kinase ERK)是MAPK信号通路下游家族成员之一,参与调控细胞有丝分裂,与细胞的增殖分化迁移密切相关。2.磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路(Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-protein kinase B (AKT))。在调节细胞代谢、凋亡、增殖和分化方面与Ras-MAPK途径同等重要。在肿瘤发生过程中起重要的辅助作用,介导气道炎性疾病嗜酸细胞的分化、降解、聚集及粘附分子的表达。3. GalGEF信号通路。使细胞免于凋亡,并加速细胞周期进程和细胞生长。4.其他。如Rac和Rho信号通路、Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子(RasGRP)信号通路、NF-kappB信号通路、转化生长因子-β(TGF-β)信号通路等。 Ras传导通路与很多疾病(包括支气管哮喘、肿瘤等)的发生发展均有密切的关系。已经证实：基于ras信号通路为靶标的抗肿瘤治疗方法,在治疗由ras突变所导致的肿瘤中具有重要的价值。目前针对Ras信号途径的药物研究主要有以下几类：(1)法尼基化转移酶抑制剂(Farnesyltransferase inhibitors, FTIs)。法呢基转移酶(Farnesyltransferase, FTIase)是Ras蛋白加工过程中最重要的催化酶之一。Ras蛋白翻译后的修饰过程主要包括三个步骤：Ras蛋白羧基末端半胱氨酸(Cys)残基的法呢酯化,经法呢酯化的Cys残基的甲基化,以及清除羧基末端的氨基酸残基。其中羧基端的法尼基化是ras蛋白定位于细胞膜内侧进而发挥效能的关键修饰步骤。因此,抑制ras蛋白翻译后羧基端的法尼基化是抑制ras信号通路的一种重要治疗手段。(2)抗Ras的反义寡核苷酸。根据Ras蛋白和mRNA序列设计反义RNA,通过碱基互补配对的方式,抑制、破坏目的基因,以下调Ras的表达。(3)抑制ras的下游靶点。通过反义核苷酸技术合成的小分子化合物能特异抑制Ras及下游靶点RafmRNA的表达,下调ERK活性。(4)抑制Ras的上游靶点。Ras蛋白上游信号通路的异常活化亦可激活Ras。小分子酪氨酸激酶抑制剂和针对细胞外受体区域的抗体,通过阻断生长因子受体酪氨酸激酶的活性,从而抑制Ras的活化。(5)恢复Ras蛋白GTP酶的活性。Ras突变导致GTP酶失活,已研制的GTP类似物可代替GAP,更有效的水解Ras蛋白。(6)其他。包括以Ras通路为靶标的基因治疗、免疫治疗,以及以Ras外周成分为靶标的或以与Ras信号通路明显相关的其他信号通路为靶标的治疗方法等。目前,基于ras信号通路为靶标的治疗策略,在人类肿瘤的治疗中显示了广阔的前景。但Ras抑制剂对支气管哮喘的干预作用及其机制尚罕见报道。反式法呢基硫代水杨酸(Trans-farnesyl thiosalicylic acid, FTS)是一种新型的Ras抑制剂,FTS对结合活化GTP的Ras具有明显的选择性,在动物模型中无明显毒性或不良副作用。目的：本研究建立小鼠哮喘模型,着重研究FTS对哮喘小鼠气道炎症,气道重塑和Th细胞分化的影响,进一步探讨Ras通路与支气管哮喘发生发展的关系,以及FTS作为Ras抑制剂,对支气管哮喘的干预机制,为哮喘的治疗提供新的思路。方法：6-8周级BALB/c小鼠60只,随机法分成六组,每组10只。正常对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组、5FTS干预组(5mg/kg)、10FTS干预组10mg/kg)、15FTS干预组(15mg/kg)。 1.制作哮喘小鼠模型：于实验第1d、第14d致敏,即卵白蛋白(OVA)40μg由1mg氢氧化铝乳化,总体积200μ1,腹腔注射。第21-27d,将小鼠置于密闭容器内,以超声雾化器雾化,3%OVA盐水气溶胶吸入激发,每天1次,每次30min。 2.药物干预：地塞米松治疗组,于每次激发前1小时腹腔注射2mg/kg地塞米松；FTS干预组,于每次激发前1小时分别腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg FTS。 3.收集实验标本：支气管肺泡灌洗液,血清,肺组织、脾组织。 4.检测实验指标 4.1小鼠左肺组织HE染色,观察组织形态学变化。 4.2检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数、嗜酸粒细胞数。 4.3酶联免疫吸附法检测小鼠血清中IL-5浓度。 4.4免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠右肺组织pan-ras, ERK蛋白表达水平,脾组织GATA-3蛋白表达水平。 4.5实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative PCR, QPCR):检测小鼠右肺组织MMP-2、MMP-9mRNA表达,脾组织Foxp3, GATA-3mRNA表达。结果： 1)肺组织形态学：正常对照组小鼠可见支气管壁光滑,上皮细胞完整,肺泡及支气管周围未见炎性细胞浸润,肺泡黏膜无肿胀。哮喘模型组小鼠,肺泡及支气管周围见可见明显炎性细胞浸润,支气管上皮水肿,气道周围小血管充血明显。地塞米松及FTS干预组,可见支气管及肺泡周围少量炎性细胞浸润,支气管及肺泡结构基本正常,炎症及充血不同程度的减轻。 2)小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞计数、血清IL-5浓度在各组间均有显著性差异(BALF细胞总数F=52.27,嗜酸细胞数F=67.61,血清IL-5浓度F=23.57,P值均为0.00)。哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸细胞数及血清IL-5浓度均较正常组增高(P0.05),地塞米松及FTS干预组各指标均低于未干预组(P0.05),且随着FTS浓度的增加,各指标下降更明显。1OFTS及15FTS组与地塞米松组相比,有更显著地疗效。但1OFTS组与15FTS组间差异无显著性。 3)小鼠肺pan-ras蛋白的表达均值在各组间有显著性差异(F=153.55,P=0.00)。哮喘组小鼠肺组织中pan-Ras的蛋白表达均较正常对照组增高(P0.05),地塞米松及FTS干预组较未干预组表达减少(P0.05),与地塞米松治疗组相比,FTS的下调作用更为明显,但无浓度依赖性。 4)小鼠脾GATA-3蛋白及GATA-3mRNA的表达均值在各组间均有显著性差异(GATA-3蛋白F=106.44, P=0.00; GATA-3mRNA F=6.02, P=0.00)。哮喘组脾组织GATA-3mRNA和GATA-3蛋白的表达较正常对照组均有增加(P0.05),地塞米松及FTS干预组较未干预组表达减少(P0.05),减少程度与FTS浓度无关。对GATA-3mRNA的表达,FTS各组疗效与地塞米松相当。对GATA-3蛋白表达,地塞米松组和FTS各相比差异显著(P0.05),提示FTS对脾GATA-3蛋白表达的抑制作用大于地塞米松组。 5)小鼠脾Foxp3mRNA的表达均值在各组间有显著性差异(F=2.85,P=0.029)。哮喘组小鼠脾组织中Foxp3mRNA表达较正常对照组减少(P0.05)。FTS干预后,表达水平较未干预组增高(P0.05),且与浓度无关。地塞米松干预后虽有升高趋势,但与未干预组相比无统计学意义(P0.05)。 6)小鼠肺ERK1/2蛋白的表达均值在各组间有显著性差异(F=92.34,P=0.00)。哮喘组小鼠肺组织ERKl/2的蛋白表达较正常对照组增高(P0.05),干预后,表达水平较未干预组减少(P0.05),减少程度与FTS浓度无关。地塞米松组与FTS组各相比差异显著(P0.05),提示FTS的作用强于地塞米松。 7)小鼠肺MMP-2、MMP-9mRNA的表达均值在各组间有显著性差异(MMP-2F=4.51, P=0.003; MMP-9F=4.68, P=0.002)。哮喘小鼠肺组织MMP-2、MMP-9表达较正常对照组增高(P0.05),干预后,表达水平较未干预组减少(P0.05),减少程度与FTS剂量无关。地塞米松组和FTS各组相比疗效无显著差异(P0.05)。结论：本文从免疫机制、神经内分泌机制等角度探讨了Ras通路与支气管哮喘发生发展的关系。通过抑制Ras信号通路可以减轻支气管哮喘小鼠的气道炎症及气道重塑,为哮喘的治疗开拓了新的思路。本研究中,FTS作为Ras抑制剂,与糖皮质激素一样,能明显改善哮喘模型小鼠气道炎症细胞浸润、减少细胞因子IL-5的分泌,下调肺组织pan-ras、ERK1/2蛋白及MMP-9、MMP-2mRNA表达水平,下调脾组织GATA-3mRNA、GATA-3蛋白表达水平,上调脾组织Foxp3mRNA表达水平。减轻哮喘小鼠气道炎症、气道重塑,促进TH1/TH2细胞平衡的恢复,增加Treg的数量及其抑制功能。其机制可能是通过抑制不同的Ras下游级联反应通路,从而调节复杂的细胞内信号传导过程,最终发挥治疗哮喘的作用。但哮喘的发病机制极为复杂,Ras信号转导途径亦是一个复杂的相互交联的网络,且与其他的信号系统相互联系。本研究亦发现FTS与地塞米松的治疗效应并不完全一致,可能二者通过影响不同的信号通路机制起效。总之,在治疗支气管哮喘方面,FTS的作用机制仍未完全清晰,尚需进一步更深入的研究。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R562.25

【参考文献】