Derlin-1在RLE-6TN细胞内质网应激诱导性凋亡中的作用研究

发布时间：2017-03-21 04:02

  本文关键词：Derlin-1在RLE-6TN细胞内质网应激诱导性凋亡中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探索抑制Derlin-1表达是否增加香烟烟雾(CSE)诱导的RLE-6TN细胞凋亡,以及其作用机理是否与内质网应激(ERS)机制相关,从而初步探讨Derlin-1在香烟烟雾诱导的RLE-6TN细胞内质网应激诱导性凋亡中作用。方法：RLE-6TN细胞培养；用携带Derlin-1干扰序列的siRNA侵染RLE-6TN细胞沉默Derlin-1基因,用加入等量空白质粒组作为对照；制备CSE；用10%CSE处理对照组、沉默组RLE-6TN细胞0h、3h、6h、12h、24h后：流式细胞仪检测干预前后细胞凋亡率；免疫荧光技术、Western blot、Realtime-PCR技术检测干预前后Derlin-1、P-IRE1、 Hrd1、P-JNK、CHOP蛋白及mRNA的表达；结果：1.流式细胞技术检测细胞凋亡：RLE-6TN细胞在10%CSE处理0h、3h、6h、12h、24h后,大鼠肺Ⅱ型上皮细胞在对照组早期凋亡率分别为：5.8%、7.1%、12.2%、14.5%、22.1%,沉默组早期凋亡率分别为为15.4%、15.7%、33%、43.3%、48.9%,对照组与沉默组细胞随时间延长细胞凋亡率呈上升趋势,沉默组细胞凋亡在早期和晚期都明显高于对照组,差异具有显著性(P0.05)。2.免疫荧光技术检测Derlin-1蛋白质荧光表达显示：自然生长的RLE-6TN细胞经CSE处理后,Derlin-1蛋白质表达水平(0.117±0.011)高于对照组(0.095±0.005),差异具有显著性(P0.05)；Derlin-1沉默组RLE-6TN细胞经CSE处理后,Derlin-1蛋白表达水平(0.064±0.003)高于对照组(0.014±0.001),差异具有显著性(P0.05)。 Derlin-1干扰前后CSE处理组Derlin-1蛋白表达水平均增加。3. Western blot检测Derlin-1蛋白表达显示：对照组RLE-6TN细胞在CSE处理Oh、3h、6h、12h、24h后Derlin-1表达分别为(1.76±0.19、1.97±0.223.75±0.23.4.85±0.70、1.01±0.11),Derlin-1蛋白在12h表达最高,24h组表达降低,不同时间时间点组之间两两比较,均有统计学意义,(P均0.05)。沉默组Derlin-1蛋白表达分别为(0.18±0.05、0.34±0.08、0.49±0.07、0.66±0.09、0.89±0.12), Derlin-1在CSE作用早期0h、3h、6h表达无明显变化,差异无统计意义(P0.05),晚期12h、24h组表达升高,有统计学意义(P0.05)；与对照组比沉默组Derlin-1蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P0.05)；RT-PCR结果显示Derlin-1 mRNA检测结果与Westen blot结果一致。4. Western blot检测ERS通路相关因子结果显示：对照组总IRE1,P-IRE1、Hrd1、总JNK、P-JNK、CHOP蛋白在CSE作用Oh、3h、6h、12h、24h组的表达别为(15.08±2、17.42±1.44、15.38±2.02、17.24±1.24、14.18±1.14；0.95±0.01、1.62±0.02、2.26±0.03、7.13±0.31、9.12±0.20;0.21±0.01、0.69±0.08、1.21±0.23、1.70±0.34、2.18±0.40;0.97±0.07、0.94±0.11、1.11±0.06、1.05±0.04、1.12±0.09：0.29±0.02、0.66±0.02、0.63±0.01、0.60±0.11、0.71±0.15;1.32±0.40、2.92±0.50、4.53±0.60、10.54±1.04、9.01±1.4),在总IRE、总JNK的表达不同时间点均无明显差异(P0.05), P-IRE1、Hrd1、P-JNK、CHOP着CSE作用时间延长呈递增趋势,不同时间时间点组之间两两比较,均有统计学意义,(P均0.05)。沉默组总IRE1、P-IRE1、Hrd1、总JNK、P-JNK、CHOP蛋白表达随CSE作用不同时间分别为(1.67±0.14、1.62±0.21、1.74±0.45、1.78±0.39、1.69±0.25;0.33±0.02、0.48±0.02、0.84±0.04、0.36±0.01、0.32±0.03;0.32±0.01、0.38±0.03、0.42±0.04、0.48±0.05、0.56±0.07;0.87±0.24、0.65±0.031、0.85±0.15、0.82±0.033、0.872±0.19;0.22±0.01、0.46±0.07、0.64±0.08、0.24±0.03、0.28±0.04;0.41±0.06、0.80±0.08、1.70±0.19、1.99±0.21、1.60±0.19),在总IRE1、JNK蛋白表达与对照组相比无明显变化,各时间点组之间统计学无明显差异(P0.05)；沉默Derlin-1基因后P-IRE1、P-JNK、CHOP早期表达升高,晚期逐渐下降,P-IRE1、P-JNK在3h、6h组与其他组之间两两比较均有统计学意义(P0.05),而在0h、12h、24h组之间差异无统计学意义(P0.05)。Hrdl在CSE作用早期0h、3h、6h表达无明显变化,差异无统计意义(P0.05),晚期12h、24h组表达升高,有统计学意义(P0.05),沉默组在3h,6h组明显低于对照组,组间差异有统计学意义(P0.05)。CHOP在3h、6h、12h时间点表达同其他各时间点组之间之间两两比较,均有统计学意义(P0.05),在0h、24h之间无明显差异(P0.05)。5. RT-PCR结果显示：Derlin-1沉默组IRE1、Hrd1、JNK、CHOP mRNA随时间表达变化同Westen blot结果基本一致。结论：CSE能够诱导AECII发生ERS并进一步介导ERAD, Derlin-1基因沉默下调ERAD作用,致使CSE诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡增加,研究结果提示Derlin-1可能对吸烟所致RLE-6TN细胞内质网应激性凋亡具有保护作用。
【关键词】：慢性阻塞性肺疾病 Ⅱ型肺泡上皮细胞 Derlin-1 香烟烟雾提取物 内质网应激 凋亡 内质网相关性降解
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 主要缩略词14-16
• 前言16-18
• 实验材料18-20
• 实验方法20-28
• 实验结果28-34
• 讨论34-40
• 结论40-42
• 参考文献42-46
• 附图46-54
• 综述54-66
• 参考文献62-66
• 硕士期间撰写论文66-68
• 致谢68

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