酶联免疫斑点检测对结核性胸膜炎诊断价值的比较研究

发布时间：2020-03-30 23:39

【摘要】： 实验背景在结核病高疫情国家,结核性胸膜炎是胸腔积液最常见原因,结核性胸膜炎诊断的金标准为胸液结核分枝杆菌检测,但阳性率低。显微镜观察的药敏试验法、噬菌体生物扩增法等病原学诊断技术,PCR、核酸探针等分子生物学技术虽得到快速发展,但对结核性胸膜炎的诊断仍受敏感度、特异度的限制。胸膜活检或胸腔镜检查均为有创性检查,不能常规应用。酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay ,ELISPOT)是近年来兴起的检测细胞免疫功能的一种方法,其检测的是经抗原刺激后分泌细胞因子的效应T淋巴细胞的数量,此方法灵敏稳定,已被越来越广泛的应用于医学研究中。其在结核病诊断方面主要集中在应用结核分枝杆菌RD1区编码的早期分泌抗原靶(early secreting antigen target 6KD ,ESAT-6)和培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10KD ,CFP-10)及其多肽作为抗原,对活动性结核病和结核潜伏感染者的外周血单个核细胞的研究,有较高的敏感度和特异度。结核性胸膜炎胸腔局部的隔室化反应证实胸液中细胞因子检测较外周血对诊断更有意义。本研究应用ELISPOT方法,检测胸腔积液单个核细胞(pleural effusion mononuclear cells,PEMC)经结核分枝杆菌RD1区编码的蛋白刺激后,分泌IFN-γ的特异性T淋巴细胞,探讨其在结核性胸膜炎诊断中的价值。实验方法本实验选取研究对象共98例,其中结核性胸腔积液患者55例,恶性胸腔积液患者43例。收集患者胸液提取单个核细胞(pleural effusion mononuclear cells ,PEMC)进行冻存,再复苏细胞并与ESAT-6及经诱导表达、纯化出的ESAT-6/CFP-10融合蛋白、CFP-10、Rv3873和Rv3879c蛋白共同孵育,进行ELISPOT试验,检测经抗原刺激后分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞(即斑点形成细胞,SFC)的数量。实验结果ESAT-6 ELISPOT、ESAT-6/CFP-10融合蛋白ELISPOT、CFP-10 ELISPOT、Rv3873 ELISPOT和Rv3879c ELISPOT的SFC数量在结核性胸腔积液组中显著高于恶性胸腔积液组;抗原ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合蛋白、CFP-10的ELISPOT结果对结核性胸膜炎诊断的敏感度无显著差异,分别为:90.9%、98.2%、89.1%,而Rv3873和Rv3879c对结核性胸膜炎诊断的敏感度较低,分别为78.2%和72.7%,两者无显著性差异。抗原ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合蛋白、CFP-10、Rv3873和Rv3879c的ELISPOT结果对结核性胸膜炎诊断的特异度总体差异无统计学意义,分别为:95.3%、83.7%、86.1%、76.7%和95.3%,而经两两比较后得到五种抗原诊断结核性胸膜炎的特异度差异无统计学意义。总体考虑ESAT-6 ELISPOT相对于所选抗原有更高的应用价值。总体考虑ESAT-6 ELISPOT相对于所选抗原有更高的应用价值。结论以RD1区编码的蛋白作为结核特异性抗原刺激胸腔积液患者的PEMC的ELISPOT检测技术是一种较为敏感和特异的方法,可为结核性和恶性积液的鉴别诊断提供参考价值。
【图文】：

特异性表达,重组表达质粒,重组蛋白,诱导表达

合、CFP-10、Rv3873 和 Rv3879c 作为抗原在大肠杆菌 BL21 (DE3)中的诱导表达和纯化、定量(一) SDS－PAGE 电泳检测蛋白的诱导表达及纯化以重组表达质粒: pET-30a(+):CFP-10 蛋白转化的 BL21 (DE3) 菌经 1.0 mmol/ L IPTG ℃诱导 3 h 和 pET-28a(+):ESAT-6/CFP-10 融合蛋白转化的 BL21 (DE3) 菌经 1.0 mmol/ L IPTG ℃诱导 4 h 后做 12%SDS-PAGE 电泳可见特异性表达带, 重组蛋白的相对分子质量约为 11000 和 18000 Da（图 1A 和图 1B）；以重组表达质粒: pET30a(+):rv3873 转化的 BL21 (DE3) 菌0.4 mmol/ L IPTG 30℃诱导 4 h 和 pET30a(+):rv3879c 转化的 BL21 (DE3) 菌经 0.4 mmol/ L IP30℃诱导 5 h 后做 10%SDS-PAGE 电泳可见特异性表达带, 重组蛋白的相对分子质量约为 47000 和 87000 Da（图 2A 和图 2B）。

诱导表达,融合蛋白,特异性表达,重组表达质粒

【参考文献】