低氧对人肺泡上皮细胞糖皮质激素受体表达的调节及对地塞米松抗炎效应的影响

发布时间：2020-04-02 20:56

【摘要】： 研究背景糖皮质激素(glucocorticoids, GC)具有广泛的抗炎和免疫抑制作用,是治疗哮喘、慢性阻塞型肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease , COPD)及肺纤维化等呼吸系统疾病的一种常见药物。糖皮质激素与糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor,GR)结合后进入核内,发挥抗炎作用。GRα和GRβ系GR基因经过不同的剪接途径产生两种主要的剪接异构体,其中GRα的表达水平和功能状态是影响GC发挥抗炎效应的主要因素。有关GC作用的分子生物学机制已经有了较为深入透彻的研究,但是以往这些研究多是在常氧状态上进行的,GC在人体内发挥作用是一个非常复杂的过程,机体的功能状态和人体细胞所处的微环境可能影响GC的各项作用。Leonard等研究发现,低氧可上调人近端肾小管上皮细胞GR的表达并增加GC的敏感性。低氧是哮喘、COPD等呼吸系统疾病发作时常常伴有的一种病理生理状态,低氧是否可以调节人体气道细胞的GR表达并影响GC抗炎效应尚不明确。目的本研究以人肺泡上皮A549细胞为模型,观察低氧对A549细胞形态及增殖周期的影响;研究低氧对人肺泡上皮细胞GRα和GRβ的表达的影响;研究低氧对地塞米松抑制LPS刺激人肺泡上皮细胞产生的IL-8的效应的影响。方法 1.A549细胞低氧培养人肺泡上皮A549细胞放入普通培养箱(37℃, 95%空气、5% CO2,常氧)和低氧小室(37℃,95%N2、25 % CO2,低氧)分别培养24h,48h,72h。 2.微分干涉显微镜(DIC)观察低氧对人肺泡上皮A549细胞形态的影响将细胞分别种于6个35mm的培养皿中,24h后更换培养基,再分别常氧和低氧条件下培养24h,48h,72h。DIC拍摄观察低氧和常氧各时间点培养的细胞形态的改变。 3.流式细胞术检测低氧对人肺泡上皮A549细胞增殖周期的影响将细胞分别种于35mm的培养皿中,待细胞贴壁后再更换无血清培养基培养24h,以达到各组细胞生长周期同步化,然后再分别低氧和常氧培养48h,收集细胞,用流式细胞术检测细胞增殖周期的变化。 4.RT-PCR检测低氧对人肺泡上皮A549细胞GRα和GRβ的mRNA表达的影响细胞常氧和低氧条件下分别培养24h,48h,72h,收集细胞抽取总RNA,然后RT-PCR法分别检测各组细胞GRα和GRβ的mRNA表达的变化 5. Western Blot检测低氧对人肺上皮A549细胞GRα和GRβ的蛋白表达的影响。细胞常氧和低氧条件下分别培养24h,48h,72h,收集细胞提取总蛋白,然后Western Blot法分别检测各组细胞GRα和GRβ的蛋白表达的变化。 6.放射免疫法检测低氧对地塞米松抑制LPS刺激产生的IL-8的影响将细胞调整至合适密度种于24孔板中,待第二天细胞贴壁且呈基本融合状态时,弃去之前的完全培养基,用PBS洗两遍后,换成无血清的培养基,并在培养基中加入LPS(10ug/ml)和不同浓度的地塞米松(10-8M-10-6M),分别低氧和常氧培养48h,然后收集细胞上清,用放射免疫法检测上清中的IL-8水平。 7.统计方法所有试验至少分4次独立完成,数据用均数±标准误表示。多组间的差异用one-way ANOVA分析,两组之间的差异用t检验,统计在SPSS 10.0软件统计包中进行,P0.05表示差异有显著性。结果 1.低氧时间依赖性的引起人肺泡上皮A549细胞形态学改变用DIC方法分别拍摄24h、48h、72h常氧和低氧条件下培养的细胞发现:低氧24h组细胞形态较常氧24h组无明显改变;而低氧48h组的细胞与常氧48h组细胞相比,细胞变大,扁平,边界模糊,细胞密度减低;低氧72h组的细胞与常氧72h组的细胞相比,这种变化趋势更加明显。 2.低氧导致人肺泡上皮A549细胞增殖受阻流式细胞术检测发现:低氧48h组的细胞,处于G1期的为88.2±0.82%,而常氧48h组的细胞处于G1期为78.2±0.64%,在低氧48h组处于G1期的细胞比例明显大于常氧48h组G1期的细胞比例,说明低氧引起了人肺泡上皮A549细胞增殖受阻。 3.低氧时间依赖性的导致人肺泡上皮A549细胞GRα表达下降 RT-PCR和Western Blot结果均表明:低氧24h组和常氧24h组相比,GRα表达的mRNA和蛋白水平无明显改变;而低氧48h组的细胞与常氧48h组细胞相比,GRα表达的mRNA和蛋白水平明显下降;低氧72h组的细胞与常氧72h组细胞相比,GRα表达下降更加明显。而且,低氧24h、48h、72h组的细胞, GRα表达的mRNA和蛋白水平呈进行性下降,说明低氧可时间依赖性的导致人肺泡上皮细胞GRα的表达下降。 4.低氧对人肺泡上皮A549细胞GRβ的表达无明显影响 RT-PCR和Western Blot结果表明:24h、48h、72h组常氧组和低氧细胞组相比, GRβ的表达的mRNA和蛋白水平均无明显改变。而且,低氧24h、48h、72h组细胞, GRβ表达的mRNA和蛋白水平也无明显改变,说明低氧对人肺泡上皮细胞GRβ的表达无明显影响。 5.低氧导致地塞米松在人肺泡上皮细胞抑制IL-8的效应减弱放射免疫法结果表明, 48h低氧培养的DEX+LPS组细胞上清的IL-8水平在10-7M和10-6M DEX浓度时,均高于相应的常氧下的DEX+LPS组细胞。而且,在低氧时,达到最大抑制效应的DEX浓度为10-7M;而在常氧时,提高DEX浓度至10-6还可以继续增加DEX的抑制效应,说明在人肺泡上皮A549细胞,低氧可导致DEX抑制IL-8的抗炎效应减弱。结论 1.低氧时间依赖性的引起人肺泡上皮A549细胞形态改变; 2.低氧导致人肺泡上皮A549细胞增殖受阻; 3.低氧时间依赖性的导致人肺泡上皮A549细胞GRα表达下降,而对人肺泡上皮A549细胞GRβ的表达无明显影响; 4.低氧导致DEX在人肺泡上皮细胞的抗炎效应减弱。
【图文】：

常氧,低氧,上皮细胞,界变

间依赖性的导致人肺泡上皮 A549 细胞形态学改变用 DIC 的方法分别拍摄了常氧和低氧培养 24h，48h 和示：低氧 24h 培养和常氧 24h 培养 A549 细胞的相比，均匀，形态无明显改变；而低氧 48h 培养和常氧 48h 培胞明显胀大，细胞不再呈椭圆球状突起，而变得扁平，界变得模糊不清，，细胞密度降低；低氧到了 72h 时，。

低氧,G1期阻滞,常氧

of the cells became bleared compared to the cells in normoxic conditions and the difference becamemore obvious till 72h.. The morphological alteration in cells was captured by DIC.注：“24-N”代表 24 小时对照组，“24-H”代表 24 小时低氧组；“48h-N”代表 48 小时对照组，“48h-H”代表 48 小时低氧组；“72h-N”代表 48 小时对照组，“72h-H”代表 72 小时低氧组。3.2 低氧导致人肺泡上皮 A549 细胞增殖受阻流式细胞学检测低氧和常氧 48h 分别培养的 A549 细胞的细胞增殖周期，结果显示：低氧时，88.2±0.82%(n =3)的细胞在 G1 期，而常氧时，79.2±0.64% (n =3)的细胞在 G1 期，在低氧 48h 时处于 G1 期的细胞比例明显大于常氧 48h 时 G1 期的细胞比例( P<0.01)，低氧时细胞发生了明显的 G1 期阻滞。这说明低氧 48h 可显著地抑制人肺泡上皮细胞 A549 的增殖。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563;R96

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