表皮生长因子受体在慢性哮喘小鼠气道重建中的作用及地塞米松的干预

发布时间：2020-04-13 11:51

【摘要】：支气管哮喘是一种呼吸系统的常见病,全球发病率、死亡率逐年增高。慢性气道炎症、气道高反应(AHR)及气道重建是哮喘主要特征。其中,气道重建导致气流不可逆的阻塞及持续气道高反应,是哮喘治疗变得困难的因素之一。因此,深入探讨气道重建的机制对发现新的、有效的哮喘治疗方法具有重要意义。近几年的研究发现,氧化应激、吸烟、过敏原、生长因子、细胞因子和炎症介质等多种因素参与了气道重建,而EGFR活化发挥中心调节作用。EGFR及其配体在气道重建中的作用复杂,进一步研究调节EGFR和配体活性机制,成为当今研究热点。本课题建立小鼠慢性哮喘模型,观察气道结构改变、肺组织EGFR表达变化、BALF中EGFR配体TGF-α浓度变化及地塞米松的干预;体外实验,进一步观察EGFR活化在TGF-α、IL-13、TNF-α促气道平滑肌细胞增殖中的作用。以期为哮喘气道重建的防治提供新思路。本课题分为五部分。第一部分慢性哮喘小鼠模型的建立目的:建立小鼠慢性哮喘模型。方法:将OVA20μg加2.6mg氢氧化铝溶于PH为7.4的PBS0.2ml中,于第0、7、14天给BALB/c小鼠腹腔注射;于第20天至第29天、第47天、第61天、第73天至第75天鼻腔内滴入OVA抗原液100μg。常规病理切片观察小鼠肺内炎症情况、气管壁厚度及气道平滑肌厚度。检测BALF中细胞数。测定气道对腺苷、乙酰胆碱的反应性。结果:OVA致敏、激发后小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛;气管、支气管及血管周围大量炎症细胞聚集;BALF中白细胞总数、嗜酸细胞及淋巴细胞均较对照组显著升高(P0.01);气管壁及气道平滑肌增厚(P0.01);气道对腺苷、乙酰胆碱的反应性增高(P0.01)。结论:用OVA致敏、激发,可以成功建立小鼠慢性哮喘模型。第二部分慢性哮喘小鼠肺内EGFR及其配体TGF-α的表达目的:探讨EGFR系统在慢性哮喘小鼠气道重建中的作用。方法:建立慢性 WP=6 哮喘小鼠模型,ELISA法测定BALF中TGF-α的浓度,RT-PCR观察小鼠肺部EGFR mRNA的表达,免疫组化及Western Blot观察EGFR蛋白的表达。结果:慢性哮喘组小鼠BALF中TGF-α浓度、肺组织EGFR mRNA及EGFR蛋白的表达较正常对照组均增高(P0.01)。结论:慢性哮喘小鼠BALF中TGF-α的浓度、肺组织EGFR的表达增高。第三部分TGF-α对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用及其机制目的:探讨TGF-α对小鼠ASMC促增殖作用及其机制。方法:分离和培养正常小鼠气道平滑肌细胞。免疫组化观察ASMC EGFR的表达。用四唑盐(MTT)比色法和3H-TdR掺入法测定加入TGF-α ASMC增殖情况。采用3H-TdR掺入法和MTT法观察AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin对TGF-α促ASM增殖的影响。用Western Blot方法测定加入不同浓度TGF-α、不同时间及加用AG1478、225mAb后ASMC磷酸化EGFR蛋白表达。结果:用MTT和3H-TdR掺入法测定ASMC培养液中加入TGF-α后ASMC增殖比对照组明显增加,并呈时间和浓度依赖性(P0.01)。AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin抑制TGF-α促ASMC增殖(P0.01)。免疫组化显示EGFR表达于ASMC 细胞膜上。经Western Blot检测,TGF-α引起ASMC磷酸化EGFR蛋白表达增高,并呈时间和浓度依赖性(P0.05)。AG1478、225mAb抑制TGF-α所致ASMC磷酸化EGFR蛋白表达的增加(P0.01)。结论:TGF-α激活EGFR为磷酸化EGFR,从而通过:1 ras-raf-MEK-erk/MAPK途径;2 PI3K-PKC-IKK途径,促进体外培养的小鼠ASMC的增殖。第四部分 EGFR在IL-13、TNF-α促小鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用目的:探讨EGFR在IL-13、TNF-α促体外培养小鼠ASMC增殖中的作用。方法:分离和培养正常小鼠ASMC。用台盼蓝染色计数分别加入IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α后,ASMC活细胞数。采用3H-TdR掺入法和MTT法观察AG1478、225mAb、TGF-α中和抗体, EGF中和抗体, HB-EGF中和抗体对IL-13、TNF-α促ASMC增殖的影响。用ELISA法测定各组细胞培养上清液中TGF-α的浓度,RT-PCR检测各组ASMC EGFR mRNA的表达,Western Blot检测ASMC EGFR蛋白和磷酸化EGFR蛋白的表达。结果:ASMC细胞数及3H-TdR掺入量,IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α组较对照组增多,IL-13+ TNF-α组增多最为明显,IL-13组次之(P0.05)。IL-13、TNF-α组MTT值及3H-TdR掺入量均较对照组增高(P0.01),AG1478、 WP=7 225mAb抑制其增高(P0.01)。经RT-PCR分析,TNF-α组EGFR mRNA的表达较对照组增加(P0.01)。经Western Blot检测,TNF-α组ASMC EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白的表达与对照组相比表达增强(P0.01),IL-13组ASMC磷酸化EGFR蛋白的表达与对照组相比表达增强(P0.01),加入AG1478、225mAb后抑制ASMC 磷酸化EGFR蛋白的表达的增加(P0.01)。IL-13+TGF-α中和抗体组、TNF-α+TGF-α中和抗体组MTT值及3H-TdR掺入量分别低于IL-13、TNF-α组。1h、3h IL-13组、TNF-α组细胞上清液中TGF-α量比对照组增加(P0.01)。结论:IL-13刺激ASMC分泌TGF-α,TGF-α与EGFR结合,EGFR活化,引起体外培养的小鼠ASMC的增殖。TNF-α刺激ASMC分泌TGF-α,及EGFR mRNA和蛋白表达,TGF-α与EGFR结合,EGFR活化,引起体外培养的小鼠气道平滑肌细胞的增殖。第五部分地塞米松对慢性哮喘小鼠气道重建及EGFR表达的影响目的:地塞米松对慢性哮喘小鼠气道重建及EGFR系统的影响。方法:建立小鼠慢性
【图文】：

气道,小鼠,气道上皮细胞,粘膜

0%(Per为“舒张”状态的Pe)。）、统计学处理数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS10.0 统计软件，两组间比用 t 检验， P<0.05 为有统计学意义。结果）、一般情况观察B 组小鼠经OVA 抗原液激发后 ,出现张口喘息 ,腹部翕动 ,易激惹 ,烦躁不,且出现喷嚏频频 ,饮水增多。而对照组小鼠行动敏捷 ,未见异常。）、病理学变化及图像分析B 组小鼠镜下可见气道周围大量炎细胞浸润，以嗜酸粒细胞、淋巴细胞为主，上皮受损 ,气道壁不完整。气道腔内粘液分泌增多 ,粘膜水肿 ,粘膜皱褶增B 组小鼠气道总管壁、内壁、气管平滑肌层均增厚（P<0.01,图 1，2，表 1）。

小鼠,细胞学变化,支气管,粘膜

.B 组小鼠气道上皮脱落、受损 ,气道壁不完整，支气管周围有大量炎细胞浸润，气道平滑肌、气道粘膜及基底膜增厚，，气道内见粘液栓 HE×200表 1.两组小鼠气道形态学参数比较（ x±s，μm）组别鼠数 WAt/ Pbm WAi/ Pbm WAm/ PbmA 组 10 12.9±1.1 8.5±1.1 4.2±0.9B 组 10 17.0±1.4*10.4±1.0*6.1±1.0**P<0.01 vs A 组）、两组小鼠 BALF 的细胞学变化B 组小鼠 BALF 中白细胞总数、嗜酸细胞及淋巴细胞均较对照组显著升高<0.01，表 2）。表 2.两组小鼠 BALF 的细胞学变化（ x±s）组别鼠数白细胞总数（×105）嗜酸粒细胞数（%）淋巴细胞数（%）
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R562.25

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