Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13机制的研究

发布时间：2020-04-14 02:14

【摘要】：Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13机制的研究支气管哮喘是一种严重危害人民身体健康的常见病、多发病。近年来,其发病率在全球范围内呈上升趋势。目前认为,支气管哮喘是以气道狭窄、高反应性和气道炎症为特征的一组综合征,气道的炎症是前两者的基础。在多种遗传和环境因素共同作用下,经过巨噬细胞(包括树突状细胞)的抗原呈递作用,相关淋巴细胞(如T细胞等)被活化,释放IL-4、IL-5、IL-13等多种Th2细胞因子,促进了支气管哮喘的形成和发展。既往研究表明,哮喘患者支气管粘膜、外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白乙酰化酶(HAT)活性明显高于正常对照,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性则减弱。应用HDAC抑制剂TSA抑制HDAC活性后,PBMCs能向Th2表型转化,IL-4、IL-5和IL-13等Th2细胞因子表达明显增加。上述研究表明,HDAC/HAT活性可能与T细胞IL-4、IL-5和IL-13等Th2细胞因子表达调控密切相关,但其中的机制尚待明确。 CD3/CD28双信号通路对淋巴细胞的刺激能够模拟其在体内受抗原活化产生Th2细胞因子的过程。本课题观察PBMCs经CD3/CD28活化后HDAC/HAT活性的变化及IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A的基因表达,研究HDAC/HAT和IL-17A在哮喘和过敏性疾病中的作用,并探讨糖皮质激素地塞米松(dexamethasone,Dex)和平喘中药雷公藤有效成分雷公藤甲素(Triptolide,TP)抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13的机制。第一部分: PBMCs活化后HDAC /HAT活性的动态变化目的:研究PBMCs在CD3/CD28单克隆抗体共刺激活化后,细胞核内HDAC /HAT活性的动态改变,以及Dex和TP对两者活性的影响,探讨HDAC /HAT在支气管哮喘等过敏性疾病中的发病机制。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)双信号通路对PBMCs进行共刺激,分别在0min、1h、4h、24h时采用荧光酶联免疫法观察HDAC /HAT活性,并观察不同浓度的Dex和TP对两者活性的影响。结果:PBMCs细胞在CD3/CD28共刺激活化后,细胞核内的HDAC活性逐渐减弱,而HAT活性逐渐增强,并且呈现出时间依赖性。Dex(10-8M、10-10M)和TP(100nM、500nM)可抑制HAT活性和增强HDAC活性,其抑制效应呈浓度和时间依赖性。结论:PBMCs细胞经过CD3/CD28共刺激活化后细胞核内HDAC活性减弱,而HAT活性增强,可能是哮喘气道变应性炎症的形成和发展机制之一;Dex和TP抑制PBMCs的HAT活性和增强HDAC活性,可能是其减轻哮喘气道炎症的重要机制之一。第二部分:Dex和TP抑制活化PBMCs表达IL-4、IL-5和IL-13的机制目的:研究PBMCs在CD3/CD28单克隆抗体共刺激活化后,细胞内IL-4、IL-5和IL-13的表达,以及Dex和TP对三者表达的影响。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)对PBMCs进行共刺激,分别在0min、24h、48h、72h时采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测细胞培养上清中IL-4、IL-5和IL-13的蛋白浓度;并用实时定量PCR的方法检测PBMCs分别在0min、6h、12h、24h不同时间段,细胞内IL-4、IL-5和IL-13mRNA的表达水平;同时观察不同浓度的Dex和TP对上述三种细胞因子表达的影响。结果: CD3/CD28单克隆抗体刺激的PBMCs培养上清中的IL-4、IL-5和IL-13的蛋白浓度明显升高,呈时间依赖性。Dex和TP可不同程度降低IL-4、IL-5和IL-13的蛋白水平,其效应呈浓度依赖性。CD3/CD28单克隆抗体共刺激后,PBMCs内IL-4、IL-5和IL-13 mRNA表达增加,在24h时TP(100nM、500nM)和Dex(10-8M)均能够明显抑制三者基因的表达。结论:PBMCs经CD3/CD28单克隆抗体刺激免疫活化后,其分泌的IL-4、IL-5和IL-13明显增加,是哮喘气道变应性炎症的形成和发展机制之一。Dex和TP可能是通过抑制HAT活性、增强HDAC活性,抑制了IL-4、IL-5、IL-13等炎症基因的表达。第三部分:TP对活化PBMCs细胞IL-17A和IFN-γ表达的影响目的:研究PBMCs细胞在CD3/CD28单克隆抗体共刺激活化后,细胞培养上清中IL-17A和IFN-γ蛋白表达水平,以及TP对两者蛋白表达的影响。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)对PBMCs进行共刺激,采用酶联免疫法(ELISA方法)检测细胞培养上清中IL-17A和IFN-γ蛋白浓度,同时观察不同浓度TP(100nM、500nM)对上述两种蛋白表达的影响。结果:PBMCs经CD3/CD28单克隆抗体刺激后,其分泌的IL-17A和IFN-γ在6h内即明显增加,并在24h内呈继续增高的趋势;100nM和500nM浓度的TP均能够显著抑制该细胞分泌IL-17A和IFN-γ。结论:PBMCs经CD3/CD28刺激活化后,其分泌的IL-17A明显增加,可能是哮喘气道变应性炎症的形成和发展机制之一;TP抑制PBMCs分泌IL-17A,可能是其治疗哮喘的机制之一。综合上面三部分结果,我们可以得出:①HDAC/HAT活性可能与T细胞IL-4、IL-5和IL-13等Th2细胞因子表达调控密切相关;②Dex和TP可能是通过抑制HAT活性、增强HDAC活性,从而抑制了IL-4、IL-5、IL-13等炎症基因的表达;③TP可通过抑制PBMCs对IL-17A的分泌,从而在哮喘和过敏性疾病中发挥一定的治疗作用。
【图文】：

抑制效应,趋势,浓度

*同 CD3/CD28 刺激组相比，P <0.05#同 0min 相比，P <0.05图 1：PBMCs 活化后 HDAC 活性变化，及 Dex 对其活性的影响PBMCs 在 CD3/CD28 共刺激活化后，细胞核内的 HDAC 活性在 1h 即明显减弱，在第 24h，仍有进一步减弱的趋势。Dex 在 24h 内可明显抑制 HDAC 的活性减弱，其抑制效应呈时间和浓度依赖。（图 1）

抑制效应,动态变化,趋势

*同 CD3/CD28 刺激组相比，P <0.05#同 0min 相比，P <0.05图 2：PBMCs 活化后 HAT 活性变化，及 Dex 对其活性的影响PBMCs 在 CD3/CD28 共刺激活化后，细胞核内的 HAT 活性在 1h 明显在第 24h，，仍有进一步增强的趋势。Dex 在 1h 起即有部分抑制 HAT 活性的这种抑制效应抑制持续到 24h。（图 2）2.PBMCs 活化后 HDAC/HAT 活性的动态变化，以及 TP 对两者活性的影###******
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R562.25

【参考文献】