水通道蛋白5敲除对呼吸道粘液表达谱的影响及其信号转导机制的研究

发布时间：2020-04-14 21:01

【摘要】： 水通道蛋白5敲除对呼吸道粘液表达谱的影响及其信号转导机制的研究第一部分水通道蛋白5在慢性哮喘小鼠模型气道炎症和粘液分泌中的作用目的气道粘液高分泌是慢性气道疾病的特征,水通道蛋白5对于呼吸道液体分泌的量起着很重要的作用,本研究从动物水平探讨在屋尘螨致敏的慢性哮喘小鼠模型中,水通道蛋白5基因敲除对气道炎症和粘液分泌的影响。方法应用水通道蛋白5基因敲除小鼠和野生型小鼠,屋尘螨滴鼻致敏制备慢性哮喘小鼠模型,HE检测病理、炎症评分,AB-PAS染色检测小鼠气道杯状细胞的增生、免疫组化和Realtime-PCR检测小鼠气道粘蛋白MUC5AC、MUC5B的表达及定量,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和MUC5AC的表达。结果屋尘螨慢性滴鼻致敏后,和野生型小鼠相比,水通道蛋白5基因敲除鼠病理评分减轻,BALF中Th2细胞因子减少,Thl细胞因子增加,BALF液中MUC5AC蛋白、肺组织中MUC5AC、MUC5B基因和蛋白表达减少。结论水通道蛋白5基因敲除慢性哮喘小鼠过敏性炎症和气道粘液分泌较野生型小鼠减轻。第二部分水通道蛋白5对PMA诱导的原代小鼠气道上皮细胞MUC5AC合成的影响目的气道上皮是呼吸道和外环境相互作用的非特异性屏障,原代培养的气道上皮细胞保留在体上皮细胞的特征和功能,是研究呼吸道上皮细胞很好的模型。本研究从细胞水平,探讨AQP5对PMA诱导的原代培养小鼠气道上皮细胞MUC5AC合成的影响及可能机制。方法原代培养两种小鼠(水通道蛋白5基因敲除鼠和野生鼠)气道上皮细胞,transwell建立气液平面,2周后扫描电镜及角蛋白免疫组化鉴定气道上皮细胞。PKC特异性激动剂PMA刺激原代小鼠气道上皮细胞及PKC通路特异性阻断剂Calphostinc阻断该通路,ELISA检测两组小鼠MUC5AC蛋白水平的变化,用western blotting检测两组小鼠气道上皮细胞PMA刺激后PKC、p-PKC、p-p38、p38、ERK、p-ERK的表达差异。结果气液平面培养后,扫描电镜显示培养的细胞上皮有微绒毛和纤毛覆盖,细胞角蛋白14免疫组化染色为阳性。PMA 20ng/ml刺激24小时后,两组小鼠气道上皮细胞分泌的MUC5AC明显升高,水通道蛋白5基因敲除鼠增加更显著,两者有显著性差异。PKC特异性阻断剂Calphostinc能阻断PMA引起的两组小鼠MUC5AC分泌。原代小鼠气道上皮细胞经PMA刺激后,western blotting检测显示PKC、p38磷酸化激活,ERK通路无变化。结论AQP5通过Ca2+-PKC-p38信号通路影响粘蛋白MUC5AC的合成和分泌。第三部分 LPS诱导的粘液下腺细胞MUC5AC和AQP5的变化和调控机制目的气道粘液分泌物由水和粘蛋白MUC5AC等组成,水／粘蛋白的比例失调导致痰液粘稠,影响纤毛清除功能。本研究从细胞水平探讨在LPS刺激粘液下腺SPC-A1细胞后,MUC5AC和AQP5的变化和调控机制。方法用LPS刺激SPC-A1细胞,Realtime-PCR检测AQP5和MUC5AC mRNA水平的变化,western blotting、ELISA法检测AQP5和MUC5AC蛋白的变化。用EGFR抑制剂AG1478及MAPKs抑制剂(ERK抑制剂PD98059、p38 MAPK抑制剂ML3404、JNK抑制剂SP600125)干预,LPS刺激SPC-A1细胞6小时后Realtime-PCR检测AQP5和MUC5ACmRNA的表达。结果LPS刺激SPC-A1细胞后,MUC5AC基因和蛋白水平呈时间、浓度依赖性升高,同时AQP5基因和蛋白水平呈时间、浓度依赖性降低,两者呈负相关。EGFR抑制剂、p38/JNK抑制剂显著降低LPS诱导的MUC5ACmRNA的升高,p38/JNK抑制剂减轻AQP5mRNA的降低。结论P38/JNK抑制剂为AQP5和MUC5AC共同的信号通路,应用P38/JNK抑制剂能同时减轻LPS诱导MUC5AC和AQP5的变化,改善水／粘液比例。
【图文】：

基因敲除,条带,鼠尾,小鼠

结果一AQPS基因敲除鼠的鉴定鼠尾PCR产物出现450饰条带为AQPS基因敲除鼠，野生型小鼠无此条带;出现270bP条带为野生型小鼠，AQPS基因敲除鼠无此条带(如图IA)。AQPS免疫组化检测显示野生型小鼠气道和肺泡I型细胞膜顶部可见棕褐色阳性染色(图IB一l)，而AQPS基因敲除鼠肺脏未见有阳性染色(图IB一2)。

屋尘,哮喘,小鼠,对照组

三.小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子的变化EUSA检测各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子，相比对照组，哮喘组小鼠细胞因子BALF中IL一。和IL一4含量分别为4012土303.13pg/ml和156.3士9.3lp留ml，较对照组明显增高(P<0.05)，IL一2、IFN一Y含量分别为18.1巧.3p留ml和82.4士7.2p创ml，较对照组下调(P<0.05);AQPS基因敲除鼠哮喘组IL一10和IL一4含量分别为3542.1士436.3pg/ml和108土8.1pg/ml，与野生鼠哮喘组相比有明显减低(P<0.05)，IL一2、IFN一丫升高含量分别为90.1士9.3pg/ml和121.2士11.6p留ml，较野生鼠哮喘组上升(P<0.05)，两组小鼠对照组无明显差异(图3)。肺泡灌洗液细胞因子检测提示AQPS基因敲除可减轻屋尘瞒致敏小鼠肺部变态反应性炎症改变。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R562.25

【参考文献】